【摘 要】
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目的 构建RelB基因siRNA慢病毒载体及检测其沉默效率.方法 针对已经筛选确定的RelB基因RNAi有效靶序列,合成5对靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经Xho I和KspAI双酶切后的pLentiLox 3.7质粒载体[含U6启动子和绿色荧光蛋白(GFP)]连接形成pLentiLox-sh-RelB慢病毒载体,PCR筛选阳性克隆,酶切测序鉴定.然后用脂质体包裹转染小鼠RM-
【机 构】
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武汉大学人民医院泌尿外科,430060;
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默效率.用pVSVG,plp1,plp2慢病毒包装系统质粒在磷酸钙介导下共转染包装细胞293T细胞,包装产生慢病毒,以293T细胞GFP蛋白的表达水平测定病毒滴度.结果 聚合酶链反应(PCR)和测序证实,成功构建RelB-shRNA的慢病毒载体pLentiLox-sh-RelB.West blot鉴定最有效的siRNA序列为5-TGTGGTCAGGcATCTGCTTG-3,病毒液过滤后测定滴度为8×1010 pfu/L.结论 成功构建小鼠RelB基因RNAi慢病毒载体.
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