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摘 要 目的：探讨大豆异黄酮（SIF）对A549细胞的抗肿瘤作用。方法：MTT比色法、光学及透射电镜法。结果：IC50附近的长春瑞滨（Vin）与IC20SIF联合治疗有明显的协同抑制作用。形态学研究表明，联合用药组可见更多的肿胀变性细胞；较轻的胞浆及核浓缩、崩解。结论：IC20SIF联合IC50前后的Vin能够明显提高Vin的抗肿瘤效果。其作用与诱导细胞凋亡关系不大，可能通过使细胞变性和阻滞于细胞周期而抑制了细胞的繁殖。
关键词 大豆异黄酮 长春瑞滨 A549细胞株
资料与方法
材料：①人肺腺癌A549细胞株：中国科学院上海细胞研究所提供。②SIF：浙江省旭东化工杭州公司提供，含量为90%。③长春瑞滨(Vin)：江苏豪森药业股份有限公司提供（批号051004，规格10mg/ml）。
细胞培养：A549细胞培养于含10%小牛血清的RMI1640培养基中；培养条件：37℃、5%CO2、100%饱和湿度。
SIF的处理：溶解于DMSO，配成320mg/ml原液，分装保存于-20℃。
MTT比色法：将2×104个/ml的细胞悬液200μl，培养于96孔培养板。24小时后加药。Vin终末浓度分别为32、16、8、4、2μg/ml，设5个平行孔，另设溶剂对照和空白对照组，培养48小时；联合组以接近IC20浓度的80μg/mlSIF(前期研究得出的数据)作用24小时后，再加入Vin，使其终末浓度同单独用药组，继续培养48小时。终止培养前4小时加入[4]5mg/mlMTT20μl，吸出培养液，加200μlDMSO，用酶标仪测定各孔光密度（A）值，重复3次，以每组A的平均值作为该组的A值。计算细胞生长抑制率：抑制率%=（对照组A－实验组A）÷（对照组A－空白对照组A）×100%。用以下公式计算两药的相互作用：q=E（AB）/（EA+EB-EA×EB）E（AB）为联合后抑制率，EA、EB为两药分别抑制率。以q＞1.15为有协同作用，0.85＜q＜1.15为相加作用，q＜0.85为拮抗作用。
H-E染色法：设联合用药组（80μg/mlSIF+IC50Vin）和单用Vin（IC50）组。将细胞悬液接种于已置入盖玻片的培养板，使细胞生长于盖玻片上。次日用药物处理，时间同MTT法。常规H-E染色，光镜下观察。
透射电镜观察：将细胞悬液培养于培养瓶，设计同上。收集细胞，常规处理，电镜下观察。
统计学处理：采用SSS11.5，均数用X+S表示，进行One-Way ANOVA分析及SNK-q检验。
结 果
各组对A549细胞的生长抑制作用：单用药组IC50=7.03μg/ml。在IC50前后，两药表现有协同作用，q（8μg/ml）=1.18＞1.15，q（4μg/ml）=0.73＜0.85，q（16μg/ml）=1.00。
倒置显微镜下观察：两组均表现为细胞变小、变圆、脱壁、分布稀疏。
H-E染色法：联合用药组表现细胞膜变薄、模糊不清及胞浆稀疏、淡染较重，胞浆及核浓缩、崩解较轻。
透射电镜观察：联合用药组线粒体肿胀、嵴断裂、空化等变性、坏死现象更典型，而胞浆及核浓缩较轻。
讨 论
国内外学者普遍认为单独服用或配合化疗应用SIF可能是一种有效的抗癌疗法［1,2］，然而其作用机制尚未完全明了。Vin是一种广谱的细胞周期特异性抗肿瘤药，适用于非小细胞肺癌、乳腺癌等患者，具有多系统器官毒性。
本实验结果表明，80μg/mlSIF联合Vin后，在IC50Vin前后协同作用明显，能以较少量的Vin获得较高的抑制率。H-E染色及透射电镜检查结果表明，SIF通过诱导细胞凋亡来抑制A549细胞生长繁殖的可能性不大，而可能通过细胞变性来抑制A549细胞的生长繁殖，此结论与Wang TC［3］的结论相一致。另外，已知Vin为细胞周期特异性药物，且SIF与其协同作用显著，根据Aguero MF［4］等的研究结论，推测SIF可能也通过阻抑细胞周期而起到了明显的协同作用，此点还需要进一步研究证实。
我们可以推荐患有肺腺癌并进行Vin治疗的患者食用大豆及大豆制品来增强疗效；或者对应用Vin后毒性明显的患者，减少其用量的同时进食大豆及大豆制品来获得等同的疗效。
参考文献
1 Wang YR,Wigington D,Strugnell SA,et al.Growth inhibition of cancer cells by an active metabolite of a novel vitamin D prodrug.Anticancer Res.2005，25(6B):4333
2 Messina M.Legumes and soybeans:overview of their nutritional profiles and health effects.AmClin Nutr,1999,70:4395
3 Wang TC，Chen IL，Lu ，et al.Synthesis, antiproliferative, and antiplatelet activities of oxime and methyloxime-containing flavone and isoflavone derivatives.Bioorg Med Chem，2005，13(21):6045
4 Aguero MF,Facchinetti MM,Sheleg Z,et al.henoxodiol, a novel isoflavone,induces G1 arrest by specific loss in cyclin-dependent kinase 2 activity by p53-independent induction of p21WAF1/CI1.Cancer Res,2005，65(8)：3364
关键词 大豆异黄酮 长春瑞滨 A549细胞株
资料与方法
材料：①人肺腺癌A549细胞株：中国科学院上海细胞研究所提供。②SIF：浙江省旭东化工杭州公司提供，含量为90%。③长春瑞滨(Vin)：江苏豪森药业股份有限公司提供（批号051004，规格10mg/ml）。
细胞培养：A549细胞培养于含10%小牛血清的RMI1640培养基中；培养条件：37℃、5%CO2、100%饱和湿度。
SIF的处理：溶解于DMSO，配成320mg/ml原液，分装保存于-20℃。
MTT比色法：将2×104个/ml的细胞悬液200μl，培养于96孔培养板。24小时后加药。Vin终末浓度分别为32、16、8、4、2μg/ml，设5个平行孔，另设溶剂对照和空白对照组，培养48小时；联合组以接近IC20浓度的80μg/mlSIF(前期研究得出的数据)作用24小时后，再加入Vin，使其终末浓度同单独用药组，继续培养48小时。终止培养前4小时加入[4]5mg/mlMTT20μl，吸出培养液，加200μlDMSO，用酶标仪测定各孔光密度（A）值，重复3次，以每组A的平均值作为该组的A值。计算细胞生长抑制率：抑制率%=（对照组A－实验组A）÷（对照组A－空白对照组A）×100%。用以下公式计算两药的相互作用：q=E（AB）/（EA+EB-EA×EB）E（AB）为联合后抑制率，EA、EB为两药分别抑制率。以q＞1.15为有协同作用，0.85＜q＜1.15为相加作用，q＜0.85为拮抗作用。
H-E染色法：设联合用药组（80μg/mlSIF+IC50Vin）和单用Vin（IC50）组。将细胞悬液接种于已置入盖玻片的培养板，使细胞生长于盖玻片上。次日用药物处理，时间同MTT法。常规H-E染色，光镜下观察。
透射电镜观察：将细胞悬液培养于培养瓶，设计同上。收集细胞，常规处理，电镜下观察。
统计学处理：采用SSS11.5，均数用X+S表示，进行One-Way ANOVA分析及SNK-q检验。
结 果
各组对A549细胞的生长抑制作用：单用药组IC50=7.03μg/ml。在IC50前后，两药表现有协同作用，q（8μg/ml）=1.18＞1.15，q（4μg/ml）=0.73＜0.85，q（16μg/ml）=1.00。
倒置显微镜下观察：两组均表现为细胞变小、变圆、脱壁、分布稀疏。
H-E染色法：联合用药组表现细胞膜变薄、模糊不清及胞浆稀疏、淡染较重，胞浆及核浓缩、崩解较轻。
透射电镜观察：联合用药组线粒体肿胀、嵴断裂、空化等变性、坏死现象更典型，而胞浆及核浓缩较轻。
讨 论
国内外学者普遍认为单独服用或配合化疗应用SIF可能是一种有效的抗癌疗法［1,2］，然而其作用机制尚未完全明了。Vin是一种广谱的细胞周期特异性抗肿瘤药，适用于非小细胞肺癌、乳腺癌等患者，具有多系统器官毒性。
本实验结果表明，80μg/mlSIF联合Vin后，在IC50Vin前后协同作用明显，能以较少量的Vin获得较高的抑制率。H-E染色及透射电镜检查结果表明，SIF通过诱导细胞凋亡来抑制A549细胞生长繁殖的可能性不大，而可能通过细胞变性来抑制A549细胞的生长繁殖，此结论与Wang TC［3］的结论相一致。另外，已知Vin为细胞周期特异性药物，且SIF与其协同作用显著，根据Aguero MF［4］等的研究结论，推测SIF可能也通过阻抑细胞周期而起到了明显的协同作用，此点还需要进一步研究证实。
我们可以推荐患有肺腺癌并进行Vin治疗的患者食用大豆及大豆制品来增强疗效；或者对应用Vin后毒性明显的患者，减少其用量的同时进食大豆及大豆制品来获得等同的疗效。
参考文献
1 Wang YR,Wigington D,Strugnell SA,et al.Growth inhibition of cancer cells by an active metabolite of a novel vitamin D prodrug.Anticancer Res.2005，25(6B):4333
2 Messina M.Legumes and soybeans:overview of their nutritional profiles and health effects.AmClin Nutr,1999,70:4395
3 Wang TC，Chen IL，Lu ，et al.Synthesis, antiproliferative, and antiplatelet activities of oxime and methyloxime-containing flavone and isoflavone derivatives.Bioorg Med Chem，2005，13(21):6045
4 Aguero MF,Facchinetti MM,Sheleg Z,et al.henoxodiol, a novel isoflavone,induces G1 arrest by specific loss in cyclin-dependent kinase 2 activity by p53-independent induction of p21WAF1/CI1.Cancer Res,2005，65(8)：3364