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[摘要]目的：观察人肉芽组织内周皮细胞CD13和Collagen Ⅰ的表达情况。方法：采用免疫组织化学双染的方法观察周皮细胞与新生血管的关系以及CD13和Collagen Ⅰ的表达，并用Image c图像分析软件分析实验结果。结果：内径在14－19μm的新生血管周围无周皮细胞的表达，而内径在22－65μm的新生血管存在周皮细胞。人肉芽组织新生血管周围的周皮细胞表达CD13、Collagen Ⅰ和Desmin，肉芽组织内的新生血管周围不存在CD13-/Desmin+细胞，且CD13阳性细胞仅存在于血管内皮细胞周围。结论：人肉芽组织内的周皮细胞表达CD13和collagen Ⅰ；肉芽组织内血管新生过程中，血管内皮细胞的迁移先于周皮细胞的分化；周皮细胞的前体细胞自骨髓入血后与肉芽组织内的血管内皮细胞粘附并迁移到血管腔外，并紧邻血管内皮细胞分化为周皮细胞；周皮细胞参与了肉芽组织细胞外基质的合成，且Collagen Ⅰ参与了新生血管的稳定与改建。
[关键词]周皮细胞；血管内皮细胞；血管新生；细胞分化
[中图分类号]Q813.1 [文献标识码]A [文章编号]1008－6455(2007)07－0878－03
血管新生(angiogenesis)参与了机体众多的病理及生理过程。存在血管新生的生理过程包括创面愈合、胎盘生长等。存在血管新生的病理过程包括实质性肿瘤的生长与转移、关节炎、麻风病、增生性瘢痕和瘢痕疙瘩的形成等。在增生性瘢痕和瘢痕疙瘩的形成以及肿瘤的研究中，血管新生的研究受到了极大重视。
由于周皮细胞对血管腔的形成、新生血管的稳定、血管的改建和血管功能方面均有重要作用，因而针对周皮细胞的基础研究对于揭示血管新生相关疾病的发病机理和临床治疗具有重要意义。目前已经证明周皮细胞来源于骨髓，但其具体的前体细胞及其分化的机理仍不清楚。为进一步揭示周皮细胞的分化机理，我们进行了系列研究，本文仅涉及周皮细胞CD13和Collagen Ⅰ的表达。本文通过观察CD13在肉芽组织内的表达，研究周皮细胞的前体细胞在血管新生过程中的迁移过程；并通过观察Collagen Ⅰ的表达，观察血管新生过程中周皮细胞与细胞外基质的关系。
1 材料和方法
1．1 人烧伤创面肉芽组织的取材：烧伤创面肉芽组织来源于6名烧伤患者，男性3名，女性3名。年龄22－35岁，平均(27.5+4.85)岁。烧伤深度均为深Ⅱ度，烧伤部位为手背烧伤3例，前臂烧伤2例，胸部烧伤1例。所有患者除存在深Ⅱ度烧伤外，无其他系统严重疾病。烧伤创面总面积为体表的8％－15％，半均(11.0+2.90)％。在伤后29－42天(平均36.2+4.79天)创面植皮时，收集2mm×2mm×1cm肉芽组织。标本分为两部分，一部分肉芽组织立即进行细菌计数(细菌数为3.2×103－2.1×104CFU/g组织，细菌数指数平均为3.91+0.292)，一部分肉芽组织用4％多聚甲醛固定，常规包腊块。
1．2 人肉芽组织中周皮细胞内Desmin的表达：标本常规包腊块，制成5μm切片。采用北京中山生物工程有限公司的HistostainTM－DS双染试剂盒，按说明书对标本内的Desmin和yon willebrand因子(vWF)进行染色。第一抗体为小鼠抗Desmin单克隆抗体(福建迈新生物科技公司)，第二抗体为兔抗vWF多克隆抗体(福建迈新生物科技公司)。染色后采用Nikon TE2000S显微镜(400×视野)、DS－SMC Camera Head、Nikon Digital Sight DS－U1和ACT-2U软件对切片的8个400×视野进行采图，用Image C软件对血管内径进行测量，分别计算Desmin阴性血管内径平均值和有Desmin阳性血管内径平均值。
1．3 人肉芽组织周皮细胞对CD13和Collagen Ⅰ的表达：将每个标本进行连续5μm切片。每个标本各选取3张连续切片进行实验。采用北京中山生物工程有限公司的HistostainTM－Ds双染试剂盒，按说明书对分别标本内的CD13和vWF、Desmin和vWF、collagen Ⅰ和vWF进行染色。第一张切片的第一抗体为小鼠抗CD13单克隆抗体(福建迈新生物科技公司)，第二抗体为兔抗vWF多克隆抗体。第二张切片的第一抗体为小鼠抗desmin单克隆抗体，第二抗体为兔抗vWF多克隆抗体。第三张切片的第一抗体为兔抗Collagen Ⅰ多克隆抗体(武汉博士德生物科技有限公司)，第二抗体为兔抗vWF多克隆抗体。按说明书进行染色，染色后对细胞核进行复染。染色后采用Nikon TE2000S显微镜(400×)、DS－5MC Camera Head、Nikon Digital Sight DS－U1和ACT－2U软件对切片进行采图。
2 结果
2．1 周皮细胞在肉芽组织内的分布：肉芽组织浅层存在一些内径在14－19μm(平均为16.42+1.95μm)的新生血管，这些血管周围无周皮细胞(Desmin阳性细胞)包裹，且这些细胞为血管内皮细胞(vWF阳性)。这些血管周围无与血管内皮细胞紧密接触的Desmin阴性细胞。直径为22－65μm(平均为42.82+19.31μm)的新生血管周围存在周皮细胞包裹。
2．2 CD13和Collagen Ⅰ在新生血管内的表达：内径在14－19μm的新生血管周围无Desmin阳性细胞，也无CD13和Collagen Ⅰ阳性细胞。而内径在22－65μm的新生血管周围存在周皮细胞，且表达CD13和Collagen Ⅰ。肉芽组织内存在Desmin阴性而Collagen Ⅰ阳性细胞，但不存在Desmin阴性CD13阳性细胞。
3 讨论
周皮细胞在血管新生的过程中及随后血管的稳定、改建和功能等方面均发挥重要作用，主要体现在以下几个方面：微血管水平的血流速度取决于周皮细胞的收缩与舒张；当周皮细胞对血管内皮细胞包裹受阻碍时，如Tie－2、angiopoietin－1或组织因子缺失的小鼠胚胎内，血管新生和血管的改建均发生异常改变；周皮细胞能抑制血管内皮细胞的增殖，而当周皮细胞缺失时则会出现血管内皮细胞增生、微动脉瘤形成、血管扩张、血管改建异常和水肿。由于周皮细胞在血管新生过程中具有重要作用，因而针对周皮细胞的基础研究对于揭示血管新生相关疾病(肿瘤、增生性瘢痕和瘢痕疙瘩等)的发病机理和临床治疗具有重要意义。
目前周皮细胞的研究还不多见，主要原因是体内周皮细胞与血管内皮细胞距离很近，两者的生物学行为难以区分，另外周皮细胞在体外具有多样 性。当前，大多周皮细胞的文献均采用细胞标记物来识别周皮细胞，比较常用的有Desmin、NG2、calponin等。本实验采用的是Desmin，它在成熟的周皮细胞已经分化各个阶段的周皮细胞均有表达，是研究周皮细胞分化的理想细胞标记物。另外本实验中还采用von willebrand因子(vWF)标记血管内皮细胞，力图通过周皮细胞与血管内皮细胞的位置关系，间接的标记周皮细胞。
有研究发现周皮细胞来源于骨髓，但这些骨髓来源细胞在分化成周皮细胞之前是先迁移到创面内还是直接迁移到血管内皮细胞周围目前还不清楚。为研究这一问题，我们采用骨髓细胞的细胞标记物CD13，对创面内的骨髓来源细胞进行示踪。当然，CD13/APN(氨基肽酶N)广泛分布于多种体细胞表面，包括造血器官的基质细胞、肿瘤血管内皮细胞、各种上皮细胞(肾近曲小管上皮细胞、胆管上皮细胞、小肠刷状缘上皮细胞等)、问叶细胞肿瘤细胞等的表面。但是肉芽组织内不包含上述细胞。
我们的实验结果显示：CDl3阳性细胞仅存在于血管内皮细胞周围，且表达Desmin。由于周皮细胞来源于骨髓，因而周皮细胞的前体细胞(CD13阳性)的分化过程可能为：从骨髓释放入血后，与创面肉芽组织内的新生血管内皮细胞粘附，迁移到血管腔之外，随即在血管内皮细胞外周分化成周皮细胞。但也有可能烧伤创面的肉芽组织不同于其他创面的肉芽组织。另外也有可能周皮细胞的前体细胞由骨髓释放入血后CD13表达减弱(免疫组织化学的方法检测不到)或不表达，进入肉芽组织后又重新趋化到血管内皮细胞表面并上调CD13的表达。但从进化角度上来说，第一种假说更节省能量，更合理。
已经证明血管新生的过程中，细胞外基质的降解和合成具有重要作用。因为肉芽组织内的新生血管必须附着在细胞外基质上，作为处在新生血管外周的周皮细胞必定与细胞外基质具有紧密联系。Collegen Ⅰ是细胞外基质的主要成分。在肉芽组织内，它主要由成纤维细胞合成。实验中我们发现周皮细胞合成Collegen Ⅰ。这表明周皮细胞是肉芽组织细胞外基质代谢的重要参与者。然而值得我们深思的问题是：血管的基底膜成分是Collegen Ⅳ(主要为周皮细胞合成)，作为血管主要组成部分的周皮细胞为什么要合成Collegen Ⅰ呢?我们认为原因可能有三点：第一种可能为Collagen Ⅰ在生物体内具有重要生物学功能，周皮细胞是成纤维细胞合成Collagen Ⅰ的储备细胞；第二种可能为血管新生过程中需要Collagen Ⅰ的合成；第三种可能为肉芽组织需要周皮细胞合成Collagen Ⅰ。我们认为Collagen Ⅰ可能参与了血管新生过程中的稳定与改建，当然这需要进一步实验进行验证。
实验中我们还发现：内径较小的新生血管不存在周皮细胞包裹，而深层内径较大的新生血管则存在周皮细胞包裹。这表明血管新生过程中，血管内皮细胞的迁移早于周皮细胞的分化及包裹。
总之，人肉芽组织内的周皮细胞表达CD13和Collagen Ⅰ；肉芽组织内血管新生过程中，血管内皮细胞的迁移先于周皮细胞的分化；周皮细胞的前体细胞自骨髓入血后与肉芽组织内的血管内皮细胞粘附并迁移到血管腔外，并紧邻血管内皮细胞分化为周皮细胞；周皮细胞参与了肉芽组织细胞外基质的合成，且Collagen Ⅰ参与了新生血管的稳定与改建。
[关键词]周皮细胞；血管内皮细胞；血管新生；细胞分化
[中图分类号]Q813.1 [文献标识码]A [文章编号]1008－6455(2007)07－0878－03
血管新生(angiogenesis)参与了机体众多的病理及生理过程。存在血管新生的生理过程包括创面愈合、胎盘生长等。存在血管新生的病理过程包括实质性肿瘤的生长与转移、关节炎、麻风病、增生性瘢痕和瘢痕疙瘩的形成等。在增生性瘢痕和瘢痕疙瘩的形成以及肿瘤的研究中，血管新生的研究受到了极大重视。
由于周皮细胞对血管腔的形成、新生血管的稳定、血管的改建和血管功能方面均有重要作用，因而针对周皮细胞的基础研究对于揭示血管新生相关疾病的发病机理和临床治疗具有重要意义。目前已经证明周皮细胞来源于骨髓，但其具体的前体细胞及其分化的机理仍不清楚。为进一步揭示周皮细胞的分化机理，我们进行了系列研究，本文仅涉及周皮细胞CD13和Collagen Ⅰ的表达。本文通过观察CD13在肉芽组织内的表达，研究周皮细胞的前体细胞在血管新生过程中的迁移过程；并通过观察Collagen Ⅰ的表达，观察血管新生过程中周皮细胞与细胞外基质的关系。
1 材料和方法
1．1 人烧伤创面肉芽组织的取材：烧伤创面肉芽组织来源于6名烧伤患者，男性3名，女性3名。年龄22－35岁，平均(27.5+4.85)岁。烧伤深度均为深Ⅱ度，烧伤部位为手背烧伤3例，前臂烧伤2例，胸部烧伤1例。所有患者除存在深Ⅱ度烧伤外，无其他系统严重疾病。烧伤创面总面积为体表的8％－15％，半均(11.0+2.90)％。在伤后29－42天(平均36.2+4.79天)创面植皮时，收集2mm×2mm×1cm肉芽组织。标本分为两部分，一部分肉芽组织立即进行细菌计数(细菌数为3.2×103－2.1×104CFU/g组织，细菌数指数平均为3.91+0.292)，一部分肉芽组织用4％多聚甲醛固定，常规包腊块。
1．2 人肉芽组织中周皮细胞内Desmin的表达：标本常规包腊块，制成5μm切片。采用北京中山生物工程有限公司的HistostainTM－DS双染试剂盒，按说明书对标本内的Desmin和yon willebrand因子(vWF)进行染色。第一抗体为小鼠抗Desmin单克隆抗体(福建迈新生物科技公司)，第二抗体为兔抗vWF多克隆抗体(福建迈新生物科技公司)。染色后采用Nikon TE2000S显微镜(400×视野)、DS－SMC Camera Head、Nikon Digital Sight DS－U1和ACT-2U软件对切片的8个400×视野进行采图，用Image C软件对血管内径进行测量，分别计算Desmin阴性血管内径平均值和有Desmin阳性血管内径平均值。
1．3 人肉芽组织周皮细胞对CD13和Collagen Ⅰ的表达：将每个标本进行连续5μm切片。每个标本各选取3张连续切片进行实验。采用北京中山生物工程有限公司的HistostainTM－Ds双染试剂盒，按说明书对分别标本内的CD13和vWF、Desmin和vWF、collagen Ⅰ和vWF进行染色。第一张切片的第一抗体为小鼠抗CD13单克隆抗体(福建迈新生物科技公司)，第二抗体为兔抗vWF多克隆抗体。第二张切片的第一抗体为小鼠抗desmin单克隆抗体，第二抗体为兔抗vWF多克隆抗体。第三张切片的第一抗体为兔抗Collagen Ⅰ多克隆抗体(武汉博士德生物科技有限公司)，第二抗体为兔抗vWF多克隆抗体。按说明书进行染色，染色后对细胞核进行复染。染色后采用Nikon TE2000S显微镜(400×)、DS－5MC Camera Head、Nikon Digital Sight DS－U1和ACT－2U软件对切片进行采图。
2 结果
2．1 周皮细胞在肉芽组织内的分布：肉芽组织浅层存在一些内径在14－19μm(平均为16.42+1.95μm)的新生血管，这些血管周围无周皮细胞(Desmin阳性细胞)包裹，且这些细胞为血管内皮细胞(vWF阳性)。这些血管周围无与血管内皮细胞紧密接触的Desmin阴性细胞。直径为22－65μm(平均为42.82+19.31μm)的新生血管周围存在周皮细胞包裹。
2．2 CD13和Collagen Ⅰ在新生血管内的表达：内径在14－19μm的新生血管周围无Desmin阳性细胞，也无CD13和Collagen Ⅰ阳性细胞。而内径在22－65μm的新生血管周围存在周皮细胞，且表达CD13和Collagen Ⅰ。肉芽组织内存在Desmin阴性而Collagen Ⅰ阳性细胞，但不存在Desmin阴性CD13阳性细胞。
3 讨论
周皮细胞在血管新生的过程中及随后血管的稳定、改建和功能等方面均发挥重要作用，主要体现在以下几个方面：微血管水平的血流速度取决于周皮细胞的收缩与舒张；当周皮细胞对血管内皮细胞包裹受阻碍时，如Tie－2、angiopoietin－1或组织因子缺失的小鼠胚胎内，血管新生和血管的改建均发生异常改变；周皮细胞能抑制血管内皮细胞的增殖，而当周皮细胞缺失时则会出现血管内皮细胞增生、微动脉瘤形成、血管扩张、血管改建异常和水肿。由于周皮细胞在血管新生过程中具有重要作用，因而针对周皮细胞的基础研究对于揭示血管新生相关疾病(肿瘤、增生性瘢痕和瘢痕疙瘩等)的发病机理和临床治疗具有重要意义。
目前周皮细胞的研究还不多见，主要原因是体内周皮细胞与血管内皮细胞距离很近，两者的生物学行为难以区分，另外周皮细胞在体外具有多样 性。当前，大多周皮细胞的文献均采用细胞标记物来识别周皮细胞，比较常用的有Desmin、NG2、calponin等。本实验采用的是Desmin，它在成熟的周皮细胞已经分化各个阶段的周皮细胞均有表达，是研究周皮细胞分化的理想细胞标记物。另外本实验中还采用von willebrand因子(vWF)标记血管内皮细胞，力图通过周皮细胞与血管内皮细胞的位置关系，间接的标记周皮细胞。
有研究发现周皮细胞来源于骨髓，但这些骨髓来源细胞在分化成周皮细胞之前是先迁移到创面内还是直接迁移到血管内皮细胞周围目前还不清楚。为研究这一问题，我们采用骨髓细胞的细胞标记物CD13，对创面内的骨髓来源细胞进行示踪。当然，CD13/APN(氨基肽酶N)广泛分布于多种体细胞表面，包括造血器官的基质细胞、肿瘤血管内皮细胞、各种上皮细胞(肾近曲小管上皮细胞、胆管上皮细胞、小肠刷状缘上皮细胞等)、问叶细胞肿瘤细胞等的表面。但是肉芽组织内不包含上述细胞。
我们的实验结果显示：CDl3阳性细胞仅存在于血管内皮细胞周围，且表达Desmin。由于周皮细胞来源于骨髓，因而周皮细胞的前体细胞(CD13阳性)的分化过程可能为：从骨髓释放入血后，与创面肉芽组织内的新生血管内皮细胞粘附，迁移到血管腔之外，随即在血管内皮细胞外周分化成周皮细胞。但也有可能烧伤创面的肉芽组织不同于其他创面的肉芽组织。另外也有可能周皮细胞的前体细胞由骨髓释放入血后CD13表达减弱(免疫组织化学的方法检测不到)或不表达，进入肉芽组织后又重新趋化到血管内皮细胞表面并上调CD13的表达。但从进化角度上来说，第一种假说更节省能量，更合理。
已经证明血管新生的过程中，细胞外基质的降解和合成具有重要作用。因为肉芽组织内的新生血管必须附着在细胞外基质上，作为处在新生血管外周的周皮细胞必定与细胞外基质具有紧密联系。Collegen Ⅰ是细胞外基质的主要成分。在肉芽组织内，它主要由成纤维细胞合成。实验中我们发现周皮细胞合成Collegen Ⅰ。这表明周皮细胞是肉芽组织细胞外基质代谢的重要参与者。然而值得我们深思的问题是：血管的基底膜成分是Collegen Ⅳ(主要为周皮细胞合成)，作为血管主要组成部分的周皮细胞为什么要合成Collegen Ⅰ呢?我们认为原因可能有三点：第一种可能为Collagen Ⅰ在生物体内具有重要生物学功能，周皮细胞是成纤维细胞合成Collagen Ⅰ的储备细胞；第二种可能为血管新生过程中需要Collagen Ⅰ的合成；第三种可能为肉芽组织需要周皮细胞合成Collagen Ⅰ。我们认为Collagen Ⅰ可能参与了血管新生过程中的稳定与改建，当然这需要进一步实验进行验证。
实验中我们还发现：内径较小的新生血管不存在周皮细胞包裹，而深层内径较大的新生血管则存在周皮细胞包裹。这表明血管新生过程中，血管内皮细胞的迁移早于周皮细胞的分化及包裹。
总之，人肉芽组织内的周皮细胞表达CD13和Collagen Ⅰ；肉芽组织内血管新生过程中，血管内皮细胞的迁移先于周皮细胞的分化；周皮细胞的前体细胞自骨髓入血后与肉芽组织内的血管内皮细胞粘附并迁移到血管腔外，并紧邻血管内皮细胞分化为周皮细胞；周皮细胞参与了肉芽组织细胞外基质的合成，且Collagen Ⅰ参与了新生血管的稳定与改建。