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摘要：简述了EMS（甲基磺酸乙酯）诱变育种技术的原理、特点及在小麦诱变育种上的研究进展，介绍了小麦EMS诱变育种技术在连云港地区的应用成果。
关键词：EMS；化学诱变；小麦育种；研究；应用
中图分类号： S512.103.52文献标志码： A文章编号：1002-1302（2014）09-0080-03
收稿日期：2013-11-20
基金项目：江苏省连云港市科技计划农业攻关（编号：CN1202、CG1128）。
作者简介：任立凯（1981—），男，江苏徐州人，副研究员，主要从事小麦育种工作。E-mail：renlikai@163.com。小麦EMS（ethyl methane sulfonste，中文名：甲基磺酸乙酯）诱变育种技术就是用EMS作为化学诱变剂处理小麦，诱发其遗传基因突变，使在短期内获得有利用价值的突变体，从而为种质创新、新品种培育及基因功能的研究等创造条件。小麦EMS诱变育种与常规育种相比，具有种质创新频率高、遗传变异谱宽、育种周期短等特性，有效弥补了小麦常规育种方法短时间难以获得新性状和新基因的不足，为丰富遗传背景、完整构建小麦种子资源库提供支持。
1EMS诱变育种机理及诱变效应
EMS是一种改变 DNA 结构的烷化剂。自1953年Kolmark首次研究报道双环氧烷可以有效诱导物种突变[1]，烷化剂就广泛应用于作物的诱变育种，至今已走过60年的历程。烷化剂带有的活泼烷基能够转移到其他电子密度高的DNA分子上去，使碱基许多位置上增加了烷基，正是这种烷化作用改变了氢键的能力，导致DNA结构发生变化。烷化剂中的功能烷基并不是越多越好，烷基越多带来的毒性越大，可致供试材料死亡，因此，育种中常用含单功能基的EMS进行处理材料。EMS的烷化作用主要发生在 DNA鸟嘌呤（G）N-7位置上，烷基取代H离子后，使之成为1个带正电荷的季铵基团，并产生2种效应：一是烷化的鸟嘌呤与胸腺嘧啶配对，导致碱基替换，即G—C变为A—T，发生转换型的突变；二是鸟嘌呤的N7烷基活化为季铵基团，减弱了N9位上的N-糖苷键，致糖苷键断裂造成脱嘌呤。尽管大部分的无嘌呤位点都可以被无嘌呤内切酶系统所修复，但是有时复制在修复之前进行，脱去鸟嘌呤的DNA分子会在进一步复制时，原来的鸟嘌呤位置成了1个空位，其互补位置上的碱基就不受严格的配对限制，4种碱基都有机会进入，原来的G—C对可以变为任何碱基对如G—C、C—G、A—T、T—A，既有转换又有颠换，这种单一碱基对改变而形成的点突变是品种改良和退化特性恢复的价值所在。此外，EMS还可与核苷结构的磷酸发生反应，形成酯类而将核苷酸从磷酸与糖分子之间切断，产生染色体的缺失，从而造成置换现象。EMS所诱发的DNA结构上的变化，都可能促使不表达的基因或区段被激活，并让被掩盖的性状表现出来[2-3]。
EMS诱变频率与其他诱变剂相比，其诱变后产生的显性突变体相对较多，易于进行突变体筛选。另外，EMS化学诱变产生高频率的点突变，致使染色体畸变相对较少，生理损伤轻，在用于对诱变对象的某一特殊性状进行改良时，容易得到高产、优质的突变体。EMS诱变范围广，产生的突变体类型也相对更丰富[4]。
2小麦EMS诱变育种的研究进展
研究人员用EMS处理大麦种子成功获得突变体[5]后，就开启了EMS在小麦育种上应用的大幕，并经多年不懈探索，EMS诱变育种技术在小麦突变体筛选鉴定、种质改良创新等方面取得了很大进展。在国外，Kuraparthy等从构建EMS突变体库中筛选到控制分蘖的tin3基因，提高了小麦的有效分蘖[6]。Yasui等利用0.5% EMS乙醇溶液（乙醇浓度7%）诱变处理面包小麦cv.Kanto种子，在M2种子中发现了糯质小麦突变体，经过多代选择鉴定，在世界上首次育成了糯质普通小麦新品系K107wx1和K107wx2[7]。Bernd等用EMS诱导出1个小麦Ge2突变体[8]。Colbert等通过EMS创建了2 500 株普通软质小麦突变体库，并推算发现，每12 kb就会有一突变体产生，其创制的突变体库是目前报道突变频率最高的[9]。Slade等创建了普通小麦和硬粒小麦的突变体库，同时以小麦颗粒淀粉合成酶Ⅰ（granule bound starch synthase Ⅰ，GBSSⅠ）基因片段为引物，筛选出1 920个糯性基因小麦突变体，在此基础上，进一步将EMS化学诱变技术与定向诱导基因组局部突变技术（Targeting Induced Local Lesions IN Genomes，TILLING）相结合，从中再筛选到了246个等位基因，获得了更加丰富的遗传信息和有价值的突变个体，并育成糯性较好的小麦新品种[10-11]。
在国内，EMS诱变育种技术也取得显著进展。（1）在抗性诱变育种方面，张晓勤等利用EMS诱变获得了大麦抗叶锈病、早熟等突变体[12]；陈洋等用EMS处理抗黄矮病的小麦-中间偃麦草易位系YW642种子，从M2中筛选出32类不同性状的突变体73株[13]，为小麦抗黄矮病基因克隆和功能基因组学的进一步研究奠定了坚实的材料基础；姚秋燕等以EMS为诱变剂进行抗条锈Yr近等基因系筛选毒性变异，结果表明，弱毒性菌株CY17和强毒性菌株CY31为小种毒性突变的出发菌株，并证实毒性突变是小麦条锈病菌毒性变异的重要途径[14]，这为小麦条锈菌致病基因和无毒基因的克隆创建了材料；沈银柱等以盐迫为选择压力，利用EMS诱发小麦花药愈伤组织获得耐盐再生植株，获得的耐盐变异株离开盐胁迫3代后经盐池鉴定，后代中有52.9%的品系达到一级耐盐，表现了一定的遗传稳定性，耐盐品系的结实率也逐渐得到恢复，达到92.4%[15]；王瑾等用EMS对温麦6 号和周麦17的花药愈伤组织和幼胚愈伤组织进行处理，对EMS诱变处理后分化的224株再生植株，接种到PEG浓度为80 s/L的生根培养基中进行抗旱筛选，共得到13株抗旱植株，平均变异率为5.8%[16]。（2）在小麦EMS诱变材料的选择方面，其范围已从常用种子处理扩展到对花粉、分生组织、愈伤组织等的处理，这样使EMS诱变摆脱了植物生命周期的限制，提高了突变率。施巾帼等用0.3%～0.4%EMS处理冬小麦品种“农大139”授粉7～13 h的休眠合子，发现其M1损伤明显，M2代的有益突变频率达12.5%[17]；许耀奎等用化学诱变剂EMS处理春小麦合子，发现合子总突变率为7.91%，比种子处理高405%，合子期处理的突变率是种子期处理的2倍多[18]；周祉祯等用浸泡法处理春小麦合子，发现处理受精卵的突变率是处理种子的2.25倍[19]；崔秋华等采用注射法以不同浓度EMS处理春小麦活体植株的幼穗，染色体畸变率和微核率明显提高，并发现EMS 在0.1%～0.2%浓度下，染色体畸变率高、出愈率低，高浓度EMS处理降低了出愈率[20]；朴连恩等利用EMS处理小麦合子，进行小麦高蛋白突变体的诱发、筛选和鉴定研究，获得了比原品种蛋白质含量高3%～4%的突变体[21]。（3）在小麦种质改良创新、品种选育方面，赵天祥等利用EMS突变技术创建了小麦品种偃展4110的突变体库，并进行形态学分析和鉴定，获得了幼苗、叶、茎、穗及成熟期等生物学特性与主要农艺性状的变异体和突变体，特别是发现了自然突变中少见的变异类型，如株高在10～15 cm左右的特矮变异类型[22]；蒋方山等以EMS处理获取小麦基部小穗不孕突变体材料，观察农艺性状与基部不孕小穗的关系，构建了饱和突变体基因库[23]；薛芳等在高抗性淀粉诱变育种中以春小麦新春11为材料，筛选出7个抗性淀粉含量高且综合性状优良的M2突变家系[24]；中国科学院石家庄农业现代化研究所利用EMS处理冬小麦品种，M1代变异率达到15.7%以上，获得9个早熟、矮秆突变系，比原品种增产2.8%～205%；徐艳花等通过EMS 诱变获得722份叶、茎、穗和其他性状发生变异的突变体，利用SDSPAGE 对突变体的高分子量麦谷蛋白亚基进行分析筛选，共发现有21个缺失不同类型亚基的突变体[25]；施巾帼等利用0.3% EMS与200 Gy γ射线复合处理原东3号小麦品种，选育出了抗逆性和适应性强、落黄性好、对条锈与白粉病具有持久抗性、株高85 cm的矮原东3号；李劲松等利用EMS诱变育成了抗条锈、根腐病能力较强的面包型春小麦新品种甘春20号[26]。 3小麦EMS诱变育种技术在连云港的应用
连云港市为黄淮海中强筋专用小麦生产优势区。近几年，通过与南京农业大学较深入的科研合作，开展了小麦EMS诱变育种技术应用研究，重点在3个方面取得了一些进展。
3.1利用EMS创建了连麦2号突变体库
用0.7%EMS磷酸缓冲液对自育主栽品种连麦2号种子进行诱变处理，对获得的 M2 代植株进行农艺性状表型筛选，获得802份叶、茎、穗和其他性状如育性、生育期、早衰等发生变异的突变体，其中，叶片性状突变151份、茎性状突变174份、穗部和籽粒性状突变197份、育性突变64份、生育期突变102份、早衰突变32份、落黄性突变28份、不抽穗突变47份、死亡突变7份，突变频率分别为1.83%、2.11%、2.39%、078%、1.24%、0.39%、0.34%、0.57%、0.08%。 为黄淮麦区初步构建了适合当地种植、突变基因丰富的连麦2号 EMS突变体库，为本地区小麦功能基因组研究和新品种选育提供了基础材料。
3.2EMS对小麦耐盐性诱发突变效果较好
从2007年至今，利用EMS诱变技术进行小麦抗盐突变体研究，并结合盐浓度梯度对M1、M2进行胁迫方法筛选，这种定向筛选方法对抗逆品种的筛选特别有效。目前，筛选出耐盐种质中间材料12份，这些材料均在不同程度上表现出优良的耐盐特性和较好的遗传配合力。其中，一些已直接纳入系圃进行系统选育，并已选到2个特异性突出的穗行，分别为耐盐早熟的M582-16和耐盐抗倒的M26-7-2；还有一些作为耐盐亲本中间材料参与构成新的常规组合，如用耐盐性强的中间材料M62-503组配了3个组合0765×M62-503、（0709×济22）×M62-503、5152×M62-503，在含盐045%的鉴定圃上盐害指数分别仅为0.21、0.34、0.28，其产量分别比亲本对照高6.9%、8.1%和9.7%，表现出了较好的综合抗逆特性。
3.3EMS对小麦粒重诱发突变效果明显
在黄淮海麦区小麦产量构成中，粒重是影响产量构成要素的短板。随着施肥水平的提高，小麦育种应以增加穗粒重为主攻方向。选用当地表现适应性强、综合性状良好的主栽品种烟农19和淮麦20，用0.5% EMS进行诱变，并对诱变后代粒重突变进行选择，取得了明显的选择效果。共选中突变系86份，千粒质量变幅为32.7～58.1 g，48 g以上8份，比原亲平均千粒质量45.2 g高2.8 g；穗粒增重0.33～0.73 g的有13份，增加5 g以上的有2份，其中，突变系M20l -7千粒质量 54 g，增加6.8 g，且综合性状较好；突变体M301-07-4千粒质量达58 g，较原亲本增加12.8 g，主穗粒重增加 0.64 g，株高在 105 cm 左右，落黄好，是珍贵的大粒资源。
4展望
小麦EMS诱变育种可以创造新的种质资源，在小麦育种实践中发挥不可替代的作用，但是，应清楚认识到化学突变很多都是不定向的，有些突变会对诱变育种不利。有效添加选择压来控制诱变方向，实现定向诱变，进一步提高化学诱变的效率，并对突变后代各变异类型的发生频率及遗传规律进行高效分析，对提高突变体的利用效率和选择的准确性进行深层次的研究，这是EMS诱变育种努力的目标。
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基金项目：江苏省连云港市科技计划农业攻关（编号：CN1202、CG1128）。
作者简介：任立凯（1981—），男，江苏徐州人，副研究员，主要从事小麦育种工作。E-mail：renlikai@163.com。小麦EMS（ethyl methane sulfonste，中文名：甲基磺酸乙酯）诱变育种技术就是用EMS作为化学诱变剂处理小麦，诱发其遗传基因突变，使在短期内获得有利用价值的突变体，从而为种质创新、新品种培育及基因功能的研究等创造条件。小麦EMS诱变育种与常规育种相比，具有种质创新频率高、遗传变异谱宽、育种周期短等特性，有效弥补了小麦常规育种方法短时间难以获得新性状和新基因的不足，为丰富遗传背景、完整构建小麦种子资源库提供支持。
1EMS诱变育种机理及诱变效应
EMS是一种改变 DNA 结构的烷化剂。自1953年Kolmark首次研究报道双环氧烷可以有效诱导物种突变[1]，烷化剂就广泛应用于作物的诱变育种，至今已走过60年的历程。烷化剂带有的活泼烷基能够转移到其他电子密度高的DNA分子上去，使碱基许多位置上增加了烷基，正是这种烷化作用改变了氢键的能力，导致DNA结构发生变化。烷化剂中的功能烷基并不是越多越好，烷基越多带来的毒性越大，可致供试材料死亡，因此，育种中常用含单功能基的EMS进行处理材料。EMS的烷化作用主要发生在 DNA鸟嘌呤（G）N-7位置上，烷基取代H离子后，使之成为1个带正电荷的季铵基团，并产生2种效应：一是烷化的鸟嘌呤与胸腺嘧啶配对，导致碱基替换，即G—C变为A—T，发生转换型的突变；二是鸟嘌呤的N7烷基活化为季铵基团，减弱了N9位上的N-糖苷键，致糖苷键断裂造成脱嘌呤。尽管大部分的无嘌呤位点都可以被无嘌呤内切酶系统所修复，但是有时复制在修复之前进行，脱去鸟嘌呤的DNA分子会在进一步复制时，原来的鸟嘌呤位置成了1个空位，其互补位置上的碱基就不受严格的配对限制，4种碱基都有机会进入，原来的G—C对可以变为任何碱基对如G—C、C—G、A—T、T—A，既有转换又有颠换，这种单一碱基对改变而形成的点突变是品种改良和退化特性恢复的价值所在。此外，EMS还可与核苷结构的磷酸发生反应，形成酯类而将核苷酸从磷酸与糖分子之间切断，产生染色体的缺失，从而造成置换现象。EMS所诱发的DNA结构上的变化，都可能促使不表达的基因或区段被激活，并让被掩盖的性状表现出来[2-3]。
EMS诱变频率与其他诱变剂相比，其诱变后产生的显性突变体相对较多，易于进行突变体筛选。另外，EMS化学诱变产生高频率的点突变，致使染色体畸变相对较少，生理损伤轻，在用于对诱变对象的某一特殊性状进行改良时，容易得到高产、优质的突变体。EMS诱变范围广，产生的突变体类型也相对更丰富[4]。
2小麦EMS诱变育种的研究进展
研究人员用EMS处理大麦种子成功获得突变体[5]后，就开启了EMS在小麦育种上应用的大幕，并经多年不懈探索，EMS诱变育种技术在小麦突变体筛选鉴定、种质改良创新等方面取得了很大进展。在国外，Kuraparthy等从构建EMS突变体库中筛选到控制分蘖的tin3基因，提高了小麦的有效分蘖[6]。Yasui等利用0.5% EMS乙醇溶液（乙醇浓度7%）诱变处理面包小麦cv.Kanto种子，在M2种子中发现了糯质小麦突变体，经过多代选择鉴定，在世界上首次育成了糯质普通小麦新品系K107wx1和K107wx2[7]。Bernd等用EMS诱导出1个小麦Ge2突变体[8]。Colbert等通过EMS创建了2 500 株普通软质小麦突变体库，并推算发现，每12 kb就会有一突变体产生，其创制的突变体库是目前报道突变频率最高的[9]。Slade等创建了普通小麦和硬粒小麦的突变体库，同时以小麦颗粒淀粉合成酶Ⅰ（granule bound starch synthase Ⅰ，GBSSⅠ）基因片段为引物，筛选出1 920个糯性基因小麦突变体，在此基础上，进一步将EMS化学诱变技术与定向诱导基因组局部突变技术（Targeting Induced Local Lesions IN Genomes，TILLING）相结合，从中再筛选到了246个等位基因，获得了更加丰富的遗传信息和有价值的突变个体，并育成糯性较好的小麦新品种[10-11]。
在国内，EMS诱变育种技术也取得显著进展。（1）在抗性诱变育种方面，张晓勤等利用EMS诱变获得了大麦抗叶锈病、早熟等突变体[12]；陈洋等用EMS处理抗黄矮病的小麦-中间偃麦草易位系YW642种子，从M2中筛选出32类不同性状的突变体73株[13]，为小麦抗黄矮病基因克隆和功能基因组学的进一步研究奠定了坚实的材料基础；姚秋燕等以EMS为诱变剂进行抗条锈Yr近等基因系筛选毒性变异，结果表明，弱毒性菌株CY17和强毒性菌株CY31为小种毒性突变的出发菌株，并证实毒性突变是小麦条锈病菌毒性变异的重要途径[14]，这为小麦条锈菌致病基因和无毒基因的克隆创建了材料；沈银柱等以盐迫为选择压力，利用EMS诱发小麦花药愈伤组织获得耐盐再生植株，获得的耐盐变异株离开盐胁迫3代后经盐池鉴定，后代中有52.9%的品系达到一级耐盐，表现了一定的遗传稳定性，耐盐品系的结实率也逐渐得到恢复，达到92.4%[15]；王瑾等用EMS对温麦6 号和周麦17的花药愈伤组织和幼胚愈伤组织进行处理，对EMS诱变处理后分化的224株再生植株，接种到PEG浓度为80 s/L的生根培养基中进行抗旱筛选，共得到13株抗旱植株，平均变异率为5.8%[16]。（2）在小麦EMS诱变材料的选择方面，其范围已从常用种子处理扩展到对花粉、分生组织、愈伤组织等的处理，这样使EMS诱变摆脱了植物生命周期的限制，提高了突变率。施巾帼等用0.3%～0.4%EMS处理冬小麦品种“农大139”授粉7～13 h的休眠合子，发现其M1损伤明显，M2代的有益突变频率达12.5%[17]；许耀奎等用化学诱变剂EMS处理春小麦合子，发现合子总突变率为7.91%，比种子处理高405%，合子期处理的突变率是种子期处理的2倍多[18]；周祉祯等用浸泡法处理春小麦合子，发现处理受精卵的突变率是处理种子的2.25倍[19]；崔秋华等采用注射法以不同浓度EMS处理春小麦活体植株的幼穗，染色体畸变率和微核率明显提高，并发现EMS 在0.1%～0.2%浓度下，染色体畸变率高、出愈率低，高浓度EMS处理降低了出愈率[20]；朴连恩等利用EMS处理小麦合子，进行小麦高蛋白突变体的诱发、筛选和鉴定研究，获得了比原品种蛋白质含量高3%～4%的突变体[21]。（3）在小麦种质改良创新、品种选育方面，赵天祥等利用EMS突变技术创建了小麦品种偃展4110的突变体库，并进行形态学分析和鉴定，获得了幼苗、叶、茎、穗及成熟期等生物学特性与主要农艺性状的变异体和突变体，特别是发现了自然突变中少见的变异类型，如株高在10～15 cm左右的特矮变异类型[22]；蒋方山等以EMS处理获取小麦基部小穗不孕突变体材料，观察农艺性状与基部不孕小穗的关系，构建了饱和突变体基因库[23]；薛芳等在高抗性淀粉诱变育种中以春小麦新春11为材料，筛选出7个抗性淀粉含量高且综合性状优良的M2突变家系[24]；中国科学院石家庄农业现代化研究所利用EMS处理冬小麦品种，M1代变异率达到15.7%以上，获得9个早熟、矮秆突变系，比原品种增产2.8%～205%；徐艳花等通过EMS 诱变获得722份叶、茎、穗和其他性状发生变异的突变体，利用SDSPAGE 对突变体的高分子量麦谷蛋白亚基进行分析筛选，共发现有21个缺失不同类型亚基的突变体[25]；施巾帼等利用0.3% EMS与200 Gy γ射线复合处理原东3号小麦品种，选育出了抗逆性和适应性强、落黄性好、对条锈与白粉病具有持久抗性、株高85 cm的矮原东3号；李劲松等利用EMS诱变育成了抗条锈、根腐病能力较强的面包型春小麦新品种甘春20号[26]。 3小麦EMS诱变育种技术在连云港的应用
连云港市为黄淮海中强筋专用小麦生产优势区。近几年，通过与南京农业大学较深入的科研合作，开展了小麦EMS诱变育种技术应用研究，重点在3个方面取得了一些进展。
3.1利用EMS创建了连麦2号突变体库
用0.7%EMS磷酸缓冲液对自育主栽品种连麦2号种子进行诱变处理，对获得的 M2 代植株进行农艺性状表型筛选，获得802份叶、茎、穗和其他性状如育性、生育期、早衰等发生变异的突变体，其中，叶片性状突变151份、茎性状突变174份、穗部和籽粒性状突变197份、育性突变64份、生育期突变102份、早衰突变32份、落黄性突变28份、不抽穗突变47份、死亡突变7份，突变频率分别为1.83%、2.11%、2.39%、078%、1.24%、0.39%、0.34%、0.57%、0.08%。 为黄淮麦区初步构建了适合当地种植、突变基因丰富的连麦2号 EMS突变体库，为本地区小麦功能基因组研究和新品种选育提供了基础材料。
3.2EMS对小麦耐盐性诱发突变效果较好
从2007年至今，利用EMS诱变技术进行小麦抗盐突变体研究，并结合盐浓度梯度对M1、M2进行胁迫方法筛选，这种定向筛选方法对抗逆品种的筛选特别有效。目前，筛选出耐盐种质中间材料12份，这些材料均在不同程度上表现出优良的耐盐特性和较好的遗传配合力。其中，一些已直接纳入系圃进行系统选育，并已选到2个特异性突出的穗行，分别为耐盐早熟的M582-16和耐盐抗倒的M26-7-2；还有一些作为耐盐亲本中间材料参与构成新的常规组合，如用耐盐性强的中间材料M62-503组配了3个组合0765×M62-503、（0709×济22）×M62-503、5152×M62-503，在含盐045%的鉴定圃上盐害指数分别仅为0.21、0.34、0.28，其产量分别比亲本对照高6.9%、8.1%和9.7%，表现出了较好的综合抗逆特性。
3.3EMS对小麦粒重诱发突变效果明显
在黄淮海麦区小麦产量构成中，粒重是影响产量构成要素的短板。随着施肥水平的提高，小麦育种应以增加穗粒重为主攻方向。选用当地表现适应性强、综合性状良好的主栽品种烟农19和淮麦20，用0.5% EMS进行诱变，并对诱变后代粒重突变进行选择，取得了明显的选择效果。共选中突变系86份，千粒质量变幅为32.7～58.1 g，48 g以上8份，比原亲平均千粒质量45.2 g高2.8 g；穗粒增重0.33～0.73 g的有13份，增加5 g以上的有2份，其中，突变系M20l -7千粒质量 54 g，增加6.8 g，且综合性状较好；突变体M301-07-4千粒质量达58 g，较原亲本增加12.8 g，主穗粒重增加 0.64 g，株高在 105 cm 左右，落黄好，是珍贵的大粒资源。
4展望
小麦EMS诱变育种可以创造新的种质资源，在小麦育种实践中发挥不可替代的作用，但是，应清楚认识到化学突变很多都是不定向的，有些突变会对诱变育种不利。有效添加选择压来控制诱变方向，实现定向诱变，进一步提高化学诱变的效率，并对突变后代各变异类型的发生频率及遗传规律进行高效分析，对提高突变体的利用效率和选择的准确性进行深层次的研究，这是EMS诱变育种努力的目标。
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