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【摘要】 目的：通过香丹注射液骨折端注射，治疗家兔桡骨中段骨折的实验研究，观察转化生长因子-β(TGF-β)、碱性成纤维生长因子(bFGF)，在骨折愈合过程中的表达和分布情况；观察骨密度的测定情况，了解香丹注射液对促进骨折愈合的影响，探讨其作用机制。方法：通过手术造成家兔双侧桡骨中段3mm完全缺损的骨折模型，分设香丹组、空白组、对照组，分别予以香丹注射液、生理盐水骨折端注射、伤科接骨片灌胃。观察转化生长因子-β(TGF-β)、碱性成纤维生长因子(bFGF)，在骨折愈合中的表达和分布特点，证明有调节骨原细胞的增殖和成骨细胞、软骨细胞分化的作用；并从骨密度（BMD）、骨矿含量（BMC）、骨面积（Area）测定等方面进行研究。结果：8天时，香丹组血肿吸收明显，骨折端肿胀明显减轻，改善骨折端血运；TGF-β、bFGF染色呈弱阳性表达。15天时香丹组骨愈合骨密度测定尚无明显优势；TGF-β、bFGF染色呈阳性表达。22天时香丹组和对照组骨愈合情况已无明显差别。31天时骨密度测定香丹组优于对照组，两组均明显优于空白组；香丹组TGF-β、bFGF染色呈强阳性表达。结论：香丹注射液在骨折早中期具有明显促进骨折愈合的作用，其特点是改善骨折局部血循环；通过诱发成骨细胞的活性和增殖，直接刺激膜内成骨，促进细胞分化、成熟，并且激发成骨细胞合成Ⅰ型胶原和骨连接素，加速胶原形成和钙盐沉积，提高骨痂质量，增强骨的强度。
【关键词】 骨折愈合；骨密度；转化生长因子TGF-β；碱性成纤维生长因子bFGF；实验动物；香丹注射液
香丹注射液是心脑血管系统用药，具有良好的改善循环血量的作用，已是临床常用药物，但至今还没有人将它用于骨折端注射以促进骨折生长的报导。本研究从动物实验角度出发，从骨密度测定，骨痂生长过程中转化生长因子-β(TGF-β)、碱性成纤维生长因子(bFGF)，在骨折愈合中的表达和分布情况等方面，初探中药香丹注射液骨折断端注射对骨折愈合的影响及作用机理，为扩大香丹注射液的临床应用范围及给药途径提供理论基础。
1 材料与方法
1.1 实验动物 新西兰大白兔38只，体重2.10±0.39kg，雌雄各半，黑龙江中医药大学动物实验中心提供。
1.2 实验药物 香丹注射液：雅安三九药业有限公司，批号22-5266-川卫药准字（1998）第013660号；伤科接骨片：大连美罗中药厂有限公司，批号国药准字Z21021461；庆大霉素注射液：天津药业集团新郑股份有限公司，批号国药准字H41021258。
主要试剂为TGF-β多克隆抗体、bFGF多克隆抗体、SP试剂盒(北京中山公司)
1.3 实验方法 兔双侧桡骨中段骨缺损动物模型的建立：选用健康体重为2.10±0.39kg，新西兰白兔38只，以20%乌拉坦按3ml/kg耳缘静脉麻醉。先用剪刀剪去双前肢毛后，脱毛处理。术前肌注庆大霉素4万，常规消毒铺巾后，无菌操作下，锐性切开骨膜小心剥离，尽量保留骨膜，使用特定宽度为3mm手锯，将桡骨中段垂直锯断造成3mm缺损，注意防止尺骨损伤，冲洗后严密缝合骨膜、皮肤、骨缺损率为100T。动物清醒后，自由活动。术后庆大霉素4万单位肌注，每日1次，连用3d，术后8d创口愈合。2只创口感染，被剔除，剩36只。
1.4 分组及给药方法 动物完全随机分为三组，每组12只，先用剪刀剪去两侧前臂及腕关节区兔毛后，硫化钠溶液脱毛，以清洁术野，造模后8h，常规消毒，使用细针头，针头大易渗漏，开始于切口旁进针至骨折断端进行药物注射。香丹组——香丹注射液，空白组——生理盐水，对照组——伤科接骨片0.2g/只灌胃，注射剂量均为每只每侧每次0.5ml，每天1次注射剂量根据实验动物因子法计算得到[1]，灌胃剂量由实验动物体表面积计算得到。
2 观察指标及方法
每组分别于术后8d，15d，22d和31d以空气栓塞法各处死3只家兔，进行检查。
2.1 骨密度测定 摄片后，去皮双侧前臂甲醛固定，在哈尔滨市骨伤科医院骨密度测定室进行，采用QDR4500plus型DEXA，以双能X线吸收法，对前臂桡骨中段骨折区作骨密度（BMD）、骨矿含量（BMC）、骨面积（Area）测定，均在骨折部位取一同等条件兴趣区R1，8天、15天、22天和31天四相点检测时仪器设定参数一致，DEXA由微机自动分析打印结果。
结果：骨折兴趣区BMO、BMC、Area测定结果（表1、2、3）
表1 骨折15天BMD、BMC、Area结果比较（X±S）
注：△示与空白组相比P<0.01，#示与香丹组相比P>0.05，统计学处理：行F检验和Q检验，香丹组和对照组均明显优于空白组，香丹组与对照组无明显差别。
表2 骨折22天BMD、BMC、Area结果比较（X±S）
注：△示与空白组相比P<0.01，#示与香丹组相比P>0.05，统计学处理：行F检验和Q检验，香丹组和对照组均明显优于空白组，香丹组与对照组无明显差别。
表3 骨折31天BMD、BMC、Area结果比较（X±S）
注：△示与空白组相比P<0.01，#示与香丹组相比P>0.05，统计学处理：行F检验和Q检验，香丹组优于对照组,香丹组和对照组均明显优于空白组，。
2.2 转化生长因子-β(TGF-β)、碱性成纤维生长因子(bFGF)，在骨折愈合中的表达和分布情况 采用组织学及免疫组织化学染色(SP法)，光学显微镜下观察每一切片中TGF-β、bFGF的表达和分布情况。以平均灰度值作为免疫组化表达程度，选择同一时间段的各组免疫组织化学切片，用HPIAS-1000高清晰度病理图文报告系统，在20×20视野下，同一时间段上各组各随机选择20个视野，对各项检测指标在相关细胞中表达程度进行灰度统计。数据以x-±s表示，用SPSS13.0软件包处理数据，对各时点的灰度值进行t 检验。
2.3 结果
2.3.1 组织学观察
术后8天时骨膜反应增加，骨内膜也有类似的骨膜反应。在肉芽组织中开始有软骨细胞形成。15 天时骨折端骨膜反应停止，骨痂不再增加。软骨组织迅速再生，骨折间隙内也有软骨形成。31 天时软骨大部分已骨化 , 形成桥接骨痂。
2.3.2 免疫组织学观察
2.3.2.1 TGF-β表达：术后8天，骨膜增殖细胞、肉芽组织中的成纤维细胞、内皮细胞和成骨细胞呈阳性表达，而新形成的软骨细胞染色较浅。术后15天，除上述细胞继续呈阳性表达外，软骨细胞以及软骨基质呈明显阳性染色。术后31天，仅有活跃的成骨细胞表达阳性，而纤维组织、软骨细胞和软骨基质均染色阴性(表1)。
表1实验侧与对照侧不同时间TGF-β的表达(平均灰度值)
2.3.2.2 bFGF表达：术后8天，纤维肉芽组织中成纤维细胞、内皮细胞呈明显阳性，并可见染色阳性的未分化间充质细胞及幼稚的成骨细胞位于血管周围。术后15天骨痂内局部有新骨形成，新生骨的周围有大量阳性着色的成骨细胞，新生骨基质染色为阳性，外骨膜成骨细胞为强阳性，新形成的软骨细胞开始出现阳性染色，邻近骨断端处的肌肉组织中有大量阳性着色的未分化间充质细胞。术后31天，骨痂内大量的成熟骨组织，阳性染色的细胞数及阳性反应程度较前明显下降。活跃的成骨细胞、软骨细胞、软骨基质表达阳性，纤维组织和成熟钙化的骨基质染色阴性(表2)
表2 实验侧与对照侧不同时间bFGF的表达(平均灰度值)
3 讨论
骨折愈合是复杂的骨组织完全性再生过程，其修复的组织学过程包括血肿、炎症、骨膜反应、膜内成骨、软骨形成、软骨内成骨、骨塑形等阶段，其中伴随着复杂的生物学调节机制，大量细胞因子在不同的骨折修复阶段发挥不同的作用。许多动物试验证实，骨折愈合的不同时段会有不同的生长因子的表达。其中主要有 TGF-β、BMP、FGF、PDGF、VEGF 和 IGF 等[2]。本实验选取 TGF-β、bFGF 观察其在骨折愈合过程中表达和分布情况。TGF-β 是一族具有多种功能的蛋白多肽，广泛存在于多种组织及转化细胞中，其中以骨组织、血小板、软骨组织中含量最丰富。TGF-β 可促进细胞增殖与分化，促进细胞外基质合成，也是多种免疫细胞的自分泌或旁分泌调节因子[3]。在骨折修复初期，TGF-β 既从脱颗粒的血小板中释放出来，也在软骨痂中由增生分化的细胞合成，然后通过诱发成骨细胞的活性和增殖，直接刺激膜内成骨，并且激发成骨细胞合成Ⅰ型胶原和骨连接素。同时 TGF-β 也是最有效的化学趋化因子[4]。FGFs是一组肝素粘合多肽，有促进成纤维细胞分裂的作用。主要有两种形式，分别是aFGF和bFGF。aFGF主要促进软骨细胞增生，而bFGF主要促进成骨过程[5]。在骨折修复早期，bFGF一方面使骨组织中的成骨细胞大量增殖分化，促进骨折愈合；另一方面促使成纤维细胞有丝分裂，直接参与纤维骨痂的形成。bFGF通过跨膜酪氨酸激酶类受体发挥作用。
3.1 香丹注射液的组成及有效成份
香丹注射液（复方丹参注射液）是由丹参、降香提取物组成，其有效成份丹参酮，丹参素、原儿茶醛，一没药烯等。丹参功同四物具有活血化瘀、凉血止痛、安神消痛等作用。现代研究已证实，丹参能刺激小血管扩张，改善微循环，改善组织缺氧等作用，应用丹参可以减少骨折局部的早期血肿及增加骨折局部血液循环，从而产生一个对骨折有利的影响[5]。
3.2 香丹注射液促进骨折愈合的作用机制
3.2.1 疏通微循环、改善缺氧、增进骨折局部的血管量 良好的血运循环为骨折修复提供能源和营养物质，同时也有利于瘀血的消散，代谢产物的清除，及炎症和坏死组织的吸收[6]。
3.2.2 促进血肿的吸收、机化 血肿是骨折后的一个必然结果。骨折局部的血肿吸收和机化，是骨折愈合过程中的重要环节，血肿吸收越快，机化越迅速，其骨折愈合也就越快。本实验发现，香丹组在15天时骨折缺损区血肿基本吸收、机化、而伤科接骨片组在15天时缺损区仍有少量小血管，空白组在15天时骨缺损区仍有未机化血肿。
3.2.3 促进钙盐沉积 缺乏将足量钙质输送到断端的血供，进而导致软骨痂钙化障碍，是骨折不愈合的真正原因[7]。本研究表明，香丹能明显改善血运循环，使局部血流量增加可以加速钙盐的沉积。另外BMD、BMC测定，间接反映钙盐沉积状况。骨折早期香丹组不如对照组，但骨折22d香丹组大为改观已与对照组同步，骨折31d时香丹组明显好于对照组和空白组。
参考文献
[1]陈奇.中药药理实验方法.北京:人民卫生出版社,1994:217
[2] Khan SN, Bostrom MP, Lane JM. Bone growth factors.Orthop Clin North Am, 2000,31:375-388.
[3] Wildemann B, Schmidmaier G, Brenner N, et al.Quantification, localization, and expression of IGF-Iand TGF-beta1 during growth factor-stimulated fracturehealing. Calcif Tissue Int, 2004,74:388-397.
[4] Yu Y, Yang JL, Chapman-Sheath PJ, et al. TGF-
beta, BMPS, and their signal transducing mediators,
Smads, in rat fracture healing. J Biomed Mater Res,
2002,60:392-397
[5] Schmidmaier G, Wildemann B, Ostapowicz D, et al.Long-term effects of local growth factor (IGF-I and TGF-beta 1) treatment on fracture healing. A safety study forusing growth factors. J Orthop Res, 2004,22:514-519.
[6] 胡美珠,张菊英,刘秀兰,等.丹参注射液对家兔桡骨骨折后肢体血容量的影响,中华外科杂志,1979,17(1):33-35
[7]Guacci D. Ultrastructural aspect of hum an nonunion, His to Histopathol 1991;6:87
【关键词】 骨折愈合；骨密度；转化生长因子TGF-β；碱性成纤维生长因子bFGF；实验动物；香丹注射液
香丹注射液是心脑血管系统用药，具有良好的改善循环血量的作用，已是临床常用药物，但至今还没有人将它用于骨折端注射以促进骨折生长的报导。本研究从动物实验角度出发，从骨密度测定，骨痂生长过程中转化生长因子-β(TGF-β)、碱性成纤维生长因子(bFGF)，在骨折愈合中的表达和分布情况等方面，初探中药香丹注射液骨折断端注射对骨折愈合的影响及作用机理，为扩大香丹注射液的临床应用范围及给药途径提供理论基础。
1 材料与方法
1.1 实验动物 新西兰大白兔38只，体重2.10±0.39kg，雌雄各半，黑龙江中医药大学动物实验中心提供。
1.2 实验药物 香丹注射液：雅安三九药业有限公司，批号22-5266-川卫药准字（1998）第013660号；伤科接骨片：大连美罗中药厂有限公司，批号国药准字Z21021461；庆大霉素注射液：天津药业集团新郑股份有限公司，批号国药准字H41021258。
主要试剂为TGF-β多克隆抗体、bFGF多克隆抗体、SP试剂盒(北京中山公司)
1.3 实验方法 兔双侧桡骨中段骨缺损动物模型的建立：选用健康体重为2.10±0.39kg，新西兰白兔38只，以20%乌拉坦按3ml/kg耳缘静脉麻醉。先用剪刀剪去双前肢毛后，脱毛处理。术前肌注庆大霉素4万，常规消毒铺巾后，无菌操作下，锐性切开骨膜小心剥离，尽量保留骨膜，使用特定宽度为3mm手锯，将桡骨中段垂直锯断造成3mm缺损，注意防止尺骨损伤，冲洗后严密缝合骨膜、皮肤、骨缺损率为100T。动物清醒后，自由活动。术后庆大霉素4万单位肌注，每日1次，连用3d，术后8d创口愈合。2只创口感染，被剔除，剩36只。
1.4 分组及给药方法 动物完全随机分为三组，每组12只，先用剪刀剪去两侧前臂及腕关节区兔毛后，硫化钠溶液脱毛，以清洁术野，造模后8h，常规消毒，使用细针头，针头大易渗漏，开始于切口旁进针至骨折断端进行药物注射。香丹组——香丹注射液，空白组——生理盐水，对照组——伤科接骨片0.2g/只灌胃，注射剂量均为每只每侧每次0.5ml，每天1次注射剂量根据实验动物因子法计算得到[1]，灌胃剂量由实验动物体表面积计算得到。
2 观察指标及方法
每组分别于术后8d，15d，22d和31d以空气栓塞法各处死3只家兔，进行检查。
2.1 骨密度测定 摄片后，去皮双侧前臂甲醛固定，在哈尔滨市骨伤科医院骨密度测定室进行，采用QDR4500plus型DEXA，以双能X线吸收法，对前臂桡骨中段骨折区作骨密度（BMD）、骨矿含量（BMC）、骨面积（Area）测定，均在骨折部位取一同等条件兴趣区R1，8天、15天、22天和31天四相点检测时仪器设定参数一致，DEXA由微机自动分析打印结果。
结果：骨折兴趣区BMO、BMC、Area测定结果（表1、2、3）
表1 骨折15天BMD、BMC、Area结果比较（X±S）
注：△示与空白组相比P<0.01，#示与香丹组相比P>0.05，统计学处理：行F检验和Q检验，香丹组和对照组均明显优于空白组，香丹组与对照组无明显差别。
表2 骨折22天BMD、BMC、Area结果比较（X±S）
注：△示与空白组相比P<0.01，#示与香丹组相比P>0.05，统计学处理：行F检验和Q检验，香丹组和对照组均明显优于空白组，香丹组与对照组无明显差别。
表3 骨折31天BMD、BMC、Area结果比较（X±S）
注：△示与空白组相比P<0.01，#示与香丹组相比P>0.05，统计学处理：行F检验和Q检验，香丹组优于对照组,香丹组和对照组均明显优于空白组，。
2.2 转化生长因子-β(TGF-β)、碱性成纤维生长因子(bFGF)，在骨折愈合中的表达和分布情况 采用组织学及免疫组织化学染色(SP法)，光学显微镜下观察每一切片中TGF-β、bFGF的表达和分布情况。以平均灰度值作为免疫组化表达程度，选择同一时间段的各组免疫组织化学切片，用HPIAS-1000高清晰度病理图文报告系统，在20×20视野下，同一时间段上各组各随机选择20个视野，对各项检测指标在相关细胞中表达程度进行灰度统计。数据以x-±s表示，用SPSS13.0软件包处理数据，对各时点的灰度值进行t 检验。
2.3 结果
2.3.1 组织学观察
术后8天时骨膜反应增加，骨内膜也有类似的骨膜反应。在肉芽组织中开始有软骨细胞形成。15 天时骨折端骨膜反应停止，骨痂不再增加。软骨组织迅速再生，骨折间隙内也有软骨形成。31 天时软骨大部分已骨化 , 形成桥接骨痂。
2.3.2 免疫组织学观察
2.3.2.1 TGF-β表达：术后8天，骨膜增殖细胞、肉芽组织中的成纤维细胞、内皮细胞和成骨细胞呈阳性表达，而新形成的软骨细胞染色较浅。术后15天，除上述细胞继续呈阳性表达外，软骨细胞以及软骨基质呈明显阳性染色。术后31天，仅有活跃的成骨细胞表达阳性，而纤维组织、软骨细胞和软骨基质均染色阴性(表1)。
表1实验侧与对照侧不同时间TGF-β的表达(平均灰度值)
2.3.2.2 bFGF表达：术后8天，纤维肉芽组织中成纤维细胞、内皮细胞呈明显阳性，并可见染色阳性的未分化间充质细胞及幼稚的成骨细胞位于血管周围。术后15天骨痂内局部有新骨形成，新生骨的周围有大量阳性着色的成骨细胞，新生骨基质染色为阳性，外骨膜成骨细胞为强阳性，新形成的软骨细胞开始出现阳性染色，邻近骨断端处的肌肉组织中有大量阳性着色的未分化间充质细胞。术后31天，骨痂内大量的成熟骨组织，阳性染色的细胞数及阳性反应程度较前明显下降。活跃的成骨细胞、软骨细胞、软骨基质表达阳性，纤维组织和成熟钙化的骨基质染色阴性(表2)
表2 实验侧与对照侧不同时间bFGF的表达(平均灰度值)
3 讨论
骨折愈合是复杂的骨组织完全性再生过程，其修复的组织学过程包括血肿、炎症、骨膜反应、膜内成骨、软骨形成、软骨内成骨、骨塑形等阶段，其中伴随着复杂的生物学调节机制，大量细胞因子在不同的骨折修复阶段发挥不同的作用。许多动物试验证实，骨折愈合的不同时段会有不同的生长因子的表达。其中主要有 TGF-β、BMP、FGF、PDGF、VEGF 和 IGF 等[2]。本实验选取 TGF-β、bFGF 观察其在骨折愈合过程中表达和分布情况。TGF-β 是一族具有多种功能的蛋白多肽，广泛存在于多种组织及转化细胞中，其中以骨组织、血小板、软骨组织中含量最丰富。TGF-β 可促进细胞增殖与分化，促进细胞外基质合成，也是多种免疫细胞的自分泌或旁分泌调节因子[3]。在骨折修复初期，TGF-β 既从脱颗粒的血小板中释放出来，也在软骨痂中由增生分化的细胞合成，然后通过诱发成骨细胞的活性和增殖，直接刺激膜内成骨，并且激发成骨细胞合成Ⅰ型胶原和骨连接素。同时 TGF-β 也是最有效的化学趋化因子[4]。FGFs是一组肝素粘合多肽，有促进成纤维细胞分裂的作用。主要有两种形式，分别是aFGF和bFGF。aFGF主要促进软骨细胞增生，而bFGF主要促进成骨过程[5]。在骨折修复早期，bFGF一方面使骨组织中的成骨细胞大量增殖分化，促进骨折愈合；另一方面促使成纤维细胞有丝分裂，直接参与纤维骨痂的形成。bFGF通过跨膜酪氨酸激酶类受体发挥作用。
3.1 香丹注射液的组成及有效成份
香丹注射液（复方丹参注射液）是由丹参、降香提取物组成，其有效成份丹参酮，丹参素、原儿茶醛，一没药烯等。丹参功同四物具有活血化瘀、凉血止痛、安神消痛等作用。现代研究已证实，丹参能刺激小血管扩张，改善微循环，改善组织缺氧等作用，应用丹参可以减少骨折局部的早期血肿及增加骨折局部血液循环，从而产生一个对骨折有利的影响[5]。
3.2 香丹注射液促进骨折愈合的作用机制
3.2.1 疏通微循环、改善缺氧、增进骨折局部的血管量 良好的血运循环为骨折修复提供能源和营养物质，同时也有利于瘀血的消散，代谢产物的清除，及炎症和坏死组织的吸收[6]。
3.2.2 促进血肿的吸收、机化 血肿是骨折后的一个必然结果。骨折局部的血肿吸收和机化，是骨折愈合过程中的重要环节，血肿吸收越快，机化越迅速，其骨折愈合也就越快。本实验发现，香丹组在15天时骨折缺损区血肿基本吸收、机化、而伤科接骨片组在15天时缺损区仍有少量小血管，空白组在15天时骨缺损区仍有未机化血肿。
3.2.3 促进钙盐沉积 缺乏将足量钙质输送到断端的血供，进而导致软骨痂钙化障碍，是骨折不愈合的真正原因[7]。本研究表明，香丹能明显改善血运循环，使局部血流量增加可以加速钙盐的沉积。另外BMD、BMC测定，间接反映钙盐沉积状况。骨折早期香丹组不如对照组，但骨折22d香丹组大为改观已与对照组同步，骨折31d时香丹组明显好于对照组和空白组。
参考文献
[1]陈奇.中药药理实验方法.北京:人民卫生出版社,1994:217
[2] Khan SN, Bostrom MP, Lane JM. Bone growth factors.Orthop Clin North Am, 2000,31:375-388.
[3] Wildemann B, Schmidmaier G, Brenner N, et al.Quantification, localization, and expression of IGF-Iand TGF-beta1 during growth factor-stimulated fracturehealing. Calcif Tissue Int, 2004,74:388-397.
[4] Yu Y, Yang JL, Chapman-Sheath PJ, et al. TGF-
beta, BMPS, and their signal transducing mediators,
Smads, in rat fracture healing. J Biomed Mater Res,
2002,60:392-397
[5] Schmidmaier G, Wildemann B, Ostapowicz D, et al.Long-term effects of local growth factor (IGF-I and TGF-beta 1) treatment on fracture healing. A safety study forusing growth factors. J Orthop Res, 2004,22:514-519.
[6] 胡美珠,张菊英,刘秀兰,等.丹参注射液对家兔桡骨骨折后肢体血容量的影响,中华外科杂志,1979,17(1):33-35
[7]Guacci D. Ultrastructural aspect of hum an nonunion, His to Histopathol 1991;6:87