【摘 要】
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目的构建含NLRC5蛋白功能区的cDNA序列的真核表达载体pEGFP-C2-NLRC5,并检测其在肾成纤维细胞(COS-7)中的表达。方法采用RT-PCR法从人肝星状细胞(LX-2)中获得NLRC5蛋白功能区
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目的构建含NLRC5蛋白功能区的cDNA序列的真核表达载体pEGFP-C2-NLRC5,并检测其在肾成纤维细胞(COS-7)中的表达。方法采用RT-PCR法从人肝星状细胞(LX-2)中获得NLRC5蛋白功能区的cDNA序列片段,用EcoRⅠ和BamHⅠ双切酶将片段和载体pEGFP-C2双酶切后,酶切产物加入T4连接酶16℃连接过夜,构建真核表达载体pEGFP-C2-NLRC5。将构建成功的pEGFP-C2-NLRC5重组质粒经PCR,限制性内切酶酶切和测序鉴定后用阳离子脂质体LipofectamineTM2000将其转染至COS-7细胞,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达,Western blot法鉴定融合蛋白表达。结果阳性克隆经双酶切法鉴定可见NLRC5基因片段。转染重组质粒后可观察到绿色荧光蛋白的表达,而且主要分布在细胞质中,Western blot法也可检测到在74 ku处有一明显条带,其大小符合EGFP-NLRC5表达的蛋白(NLRC5蛋白大小约为47 ku,EGFP蛋白大小约为27 ku),表明融合蛋白可在哺乳动物细胞中成功表达。结论成功构建pEGFP-C2-NLRC5质粒,NLRC5蛋白可在COS-7细胞中成功表达。
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