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[摘要] 目的 探讨川芎素对大鼠肾脏缺血再灌注损伤（I/R）保護作用及其机制。
方法 雄性SD大鼠随机分为假手术组、I/R组、川芎素组（10 μmol/kg腹腔注射，LC组）、LC+Notch1通路激活剂rhNF-κB组（LC+rhNF-κB组），每组15只。观察各组血尿素氮（BUN）和血清肌酐（Scr）水平，采用实时定量PCR（qRT-PCR）和蛋白免疫印迹（Western blot）方法检测肾组织肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素-6（IL-6）的mRNA和蛋白表达水平，免疫组化和Western blot检测肾组织Caspase3、Bax/Bcl-2、Notch1、Jagged1的表达水平。
结果 I/R组肾组织结构严重破坏，BUN、Scr、TNF-α、IL-6、Caspase3、Bax/Bcl-2、Notch1、Jagged1的表达均显著高于假手术组（P均<0.05），而LC组中上述蛋白的表达均显著低于I/R组（P均<0.05）。另外，LC+rhNF-κB组中BUN、Scr、TNF-α、IL-6、Caspase3、Bax/Bcl-2的表达与LC组相比均显著上调（P均<0.05）。
结论 川芎素通过抑制Notch1活化抑制肾组织的损伤和炎症反应。
[关键词] 再灌注损伤;急性肾损伤;川芎嗪;受体，Notch1;炎症;大鼠，Sprague-Dawley
[中图分类号] R619.9
[文献标志码] A
[文章编号] 2096-5532（2021）05-0725-06
doi：10.11712/jms.2096-5532.2021.57.172
[开放科学（资源服务）标识码（OSID）]
[网络出版] https：//kns.cnki.net/kcms/detail/37.1517.R.20211101.0853.001.html;2021-11-01 11：51：01
ROLE OF SODIUM FERULATE IN ISCHEMIA-REPERFUSION INJURY IN RATS AND ITS MECHANISM
JIANG Xin， QU Qingshan， LIANG Shaofeng， FANG Jun， SUN Dong
（Department of Organ Transplantation， Zhengzhou People’s Hospital， Zhengzhou 450000， China）
[ABSTRACT] Objective To investigate the protective effect of sodium ferulate against renal ischemia-reperfusion （I/R） injury in rats and its mechanism.
Methods Male Sprague-Dawley rats were randomly divided into sham-operation group， I/R group， sodium ferulate group （10 μmol/kg by intraperitoneal injection）， and sodium ferulate+Notch1 pathway activator rhNF-κB group （sodium ferulate+rhNF-κB group）， with 15 rats in each group. The levels of blood urea nitrogen （BUN） and serum creatinine （Scr） were observed for each group; quantitative real-time PCR and Western blot were used to measure the mRNA and protein expression levels of tumor necrosis factor-α （TNF-α） and interleukin-6 （IL-6） in renal tissue; immunohistochemistry and Western blot were used to measure the expression levels of Caspase3， Bax/Bcl-2， Notch1， and Jagged1 in renal tissue.
Results
Compared with the sham-operation group， the I/R group had severe structural damage of renal tissue and significantly higher expression levels of BUN， Scr， TNF-α， IL-6， Caspase3， Bax/Bcl-2， Notch1， and Jagged1 （all P<0.05）， and the sodium ferulate group had significantly lower expression levels of the above proteins than the I/R group （all P<0.05）. In addition， compared with the sodium ferulate group， the sodium ferulate+rhNF-κB group had significantly upregulated expression levels of BUN， Scr， TNF-α， IL-6， Caspase3， and Bax/Bcl-2 （all P<0.05）. Conclusion Sodium ferulate inhibits renal tissue injury and inflammation by inhibiting the activation of Notch1.
[KEY WORDS] reperfusion injury; acute kidney injury; Tetramethylpyrazine; receptor， Notch1; inflammation; rats， Sprague-Dawley
肾脏缺血再灌注损伤（I/R）是引起急性肾损伤（AKI）的主要病因[1]。AKI和肾I/R均导致肾功能迅速下降[2-3]，但目前缺乏预防或治疗AKI的有效策略[3]。肾I/R发展过程涉及活性氧（ROS）的产生、促炎症反应和细胞死亡等[4-7]，且导致肾小管上皮细胞的损伤[8-9]。细胞凋亡是肾脏I/R中肾小管上皮细胞死亡的主要类型[10]。长期以来川芎一直被应用于心血管疾病的治疗，如卒中[11]和冠心病[12]，特別是在我国、日本和韩国应用广泛[13]。已有研究结果表明，川芎素（LC）可以保护急性缺血性肾损伤[14]，而鲜见其对缺血后再灌注肾损伤保护作用的研究。因此，本研究的目的是探讨LC对大鼠肾I/R的保护作用，并探讨Notch通路对大鼠肾脏I/R中介导的炎症反应和细胞凋亡的作用及其可能机制，为LC作为治疗肾脏I/R的新策略提供数据支持。现将结果报告如下。
1 材料和方法
1.1 实验材料
1.1.1 实验动物 选择健康雄性、SPF级Sprague-Dawley（SD）大鼠60只，体质量211～248 g，购于我院实验动物中心，饲养于SPF级动物实验室，动物自由饮食、饮水。本研究严格遵守《实验动物护理和使用指南》的执行原则。
1.1.2 主要试剂及药物 LC购于中国河北安国神农中草药公司;兔抗大鼠的肿瘤坏死因子α（TNF-α）（ab6671）、白细胞介素-6（IL-6）（ab208113）、半胱天冬酶3（Caspase3）（ab13847）、B细胞淋巴瘤/白血病相关X的蛋白（BAX）（ab32503）、B细胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）（ab196495）、缺口蛋白1（Notch1）（ab52301）、锯齿状蛋白1（Jagged1）（ab233101）的第一抗体、辣根过氧化物酶（HRP）标记山羊抗兔第二抗体（ab6721）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH，ab9485）等均购于美国Abcam公司;SYBR Green qPCR Master Mix试剂购于MedChemExpress公司;组织蛋白抽提试剂购自上海碧云天生物科技有限公司。血清肌酐（Scr）和尿素氮（BUN）试剂盒购于美国R&D Systems公司。
1.2 实验方法
1.2.1 实验分组 取雄性SD大鼠60只，适应性喂养1周后，随机分为假手术组（a组）、I/R组（b组）、LC组（c组）和LC+Notch1通路激活剂rhNF-κB组（LC+rhNF-κB组，d组），每组15只。
1.2.2 模型建立及标本采集 大鼠术前禁食8 h，不禁水，100 g/L水合氯醛（3.5 mL/kg）腹腔注射麻醉。常规固定、消毒、铺巾，腹正中切口，游离肾蒂，I/R组以无创小血管夹同时夹闭双侧肾蒂50 min，之后松开血管夹，让血流再通。假手术组、LC组、LC+rhNF-κB组大鼠手术方式与I/R组相同，但假手术组不用血管夹阻断血流，而LC组、LC+rhNF-κB组在松开血管夹时予LC（10 μmol/kg）腹腔注射，I/R组与假手术组则以等量生理盐水注射液腹腔注射。各组分别于再灌注6、12、24、48 h共4个时点取血标本（腹主动脉穿刺），在48 h取肾脏组织标本。右肾用冰生理盐水冲洗后置液氮保存，行实时定量PCR（qRT-PCR）和蛋白免疫印迹（Western blot）检测;左肾用40 g/L甲醛固定缓冲液固定，待制备石蜡切片。
1.2.3 酶联免疫吸附（ELISA）检测 将血清保存在-80 ℃冰箱，通过ELISA试剂盒检测血清肌酐（Scr）和血尿素氮（BUN）水平。
1.2.4 苏木精-伊红（HE）和免疫组织化学染色 按照HE染色试剂盒说明将5 μm肾组织石蜡切片进行HE染色。使用常规免疫组织化学法（IHC）检测Notch1在肾脏组织表达，Notch1抗体的稀释度为1∶100。使用GTVsionTM Ⅲ检测系统（GK5007，Gene Tech，中国）记录所有IHC图像。
1.2.5 qRT-PCR检测 按照TianGen试剂盒说明书步骤提取大鼠肾组织总RNA，并按照TAKARA（RR047A）试剂盒说明进行反转录。参照SYBR Green Master Mix PCR试剂盒说明进行qPCR扩增，所用引物及其序列见表1。以人GAPDH基因作为内参照，采用2-ΔΔCT法计算IL-6和TNF-α的mRNA相对表达量。
1.2.6 Western blot检测 按照RIPA裂解缓冲液试剂盒说明书提取肾脏组织的总蛋白，并使用BCA试剂盒检测浓度。蛋白经过SDS-PAGE电泳和转膜操作后，分别孵育TNF-α（1∶600）、IL-6（1∶600）、Caspase3（1∶500）、Bax（1∶800）、Bcl-2（1∶400）、Notch1（1∶500）和Jagged1（1∶500）抗体和对应的二抗。蛋白条带显色后，用Image J软件分析比较目的条带/内参照（GAPDH）条带灰度值。
1.3 统计学处理
应用SPSS 20.0统计软件对数据进行处理分析。其中计量资料数据采用±s的形式表示，两组均数的比较采用两独立样本比较的t检验;多组间的均数比较采用单因素方差分析，均数两两之间的比较采用Bonferroni法。以P<0.05为差异有统计学意义。 2 结 果
2.1 I/R模型大鼠肾脏结构和功能变化
HE染色结果显示，假手术组大鼠肾脏结构无明显形态学改变;而与假手术组相比，I/R组的肾组织结构出现严重破坏，包括肾小管扩张、肾上皮细胞扁平、刷状缘丧失和核染色丧失等（图1A）。另外，I/R组大鼠血BUN和Scr水平在12、24和48 h等3个时间点均明显高于假手术组，差异均有显著性（t=10.532～17.693，P均<0.05）。见图1B。
2.2 LC对I/R大鼠肾组织结构和Notch1信号通路的影响
HE染色结果显示，与I/R组相比，LC组破坏的肾组织的结构有明显恢复;与I/R+LC组相比，I/R+LC+rhNF-κB组的肾组织结构破坏又加重。见图2A。肾组织中的Notch1和Jagged1表达检测结果显示，4组Notch1和Jagged1的均数差异有统计学意义（F=256.311、189.106，P均<0.05）。两两比较的结果显示，与假手术组相比较，I/R组中Notch1和Jagged1在肾组织中表达上调（P均<0.05）;与I/R组相比， LC组Notch1和Jagged1的表达下调（P均<0.05）;使用Notch1信号激活剂rhNF-κB处理后与LC组相比，LC+rhNF-κB组的Notch1和Jagged1的表达明显恢复（P均<0.05），见图2B～E。另外，4组的BUN、Scr均数差异有统计学意义（F=182.060、183.772，P均<0.05）。两两比较结果显示，与I/R组相比，在LC组中BUN、Scr水平降低（P均<0.05）;但是与LC组相比较，LC+rhNF-κB组的BUN、Scr水平又增加，但并未超过I/R组，差异均有统计学意义（P均<0.05）。见图2F。
2.3 LC对I/R大鼠肾脏炎症相关指标表达的影响
本文4组肾脏组织IL-6和TNF-α的mRNA表达差别有显著意义（F=203.012、214.310，P均<0.05）。两两比较结果显示，与假手术组相比，I/R组肾脏组织IL-6和TNF-α的mRNA表达升高（P均<0.05）;而与I/R组相比，LC组肾脏组织IL-6和TNF-α的mRNA表达水平降低（P均<0.05）;但是LC+rhNF-κB组IL-6和TNF-α的mRNA表达部分恢复（P均<0.05）。见图3A、B。4组大鼠肾脏组织IL-6和TNF-α的蛋白表达水平差异有显著意义（F=113.412、128.204，P均<0.05）。两两比较结果显示，与假手术组相比，I/R组肾脏组织IL-6和TNF-α的蛋白表达水平升高（P均<0.05）;而与I/R组相比，LC组肾脏组织IL-6和TNF-α的蛋白表达水平降低（P均<0.05）;但是LC+rhNF-κB组IL-6和TNF-α的蛋白表达水平部分恢复（P均<0.05）。见图3C～F。
2.4 LC对I/R大鼠肾脏细胞凋亡相关标志物表达的影响
本文4组Caspase3和Bax/Bcl-2表达差别有统计学意义（F=156.205、143.337，P均<0.05）。两两比较结果显示，Caspase3和Bax/Bcl-2在I/R组的表达均高于假手术组（P均<0.05），而二者在LC组的表达均低于I/R组（P均<0.05），二者在LC+rhNF-κB组大鼠肾组织表达均高于LC组（P均<0.05）。见图4A～C。
3 讨 论
AKI是一种潜在的致命疾病，病人死亡率高。肾脏I/R是AKI的主要原因[15]。有研究显示，当肾动脉灌注压力处于10.64～23.94 kPa范围时，肾血流将随着灌注压力的变化相应地变化。但是，当灌注压力低于10.64 kPa时，肾血流量急剧降低，形成缺血并造成不可逆性损伤[16]。不幸的是，唯一合适的治疗方法是肾移植和肾透析。因此，迫切需要找到一种有效的药物来预防或者治疗I/R。LC可能对AKI具有保护作用，但是否能够改善肾I/R仍不明确。因此，我们分析了在体内LC对肾I/R大鼠的影响。结果表明，LC可通过抑制Notch1活化，抑制I/R大鼠的肾组织损伤和炎症反应，从而发挥肾脏保护作用。
炎症反应增强是肾I/R的另一个明显的特征，I/R可以引发肾脏炎性细胞增多、促炎性因子（如TNF-α、IL-1β、IL-6等）的水平升高以及黏附分子增加，这些因子共同作用激发炎症的级联反应，放大局部炎症反应，甚至引起器官损伤[17]。本研究检测肾I/R后肾组织中IL-6和TNF-α的mRNA和蛋白表达水平，结果表明，无论在血清中还是在肾脏组织中炎症因子的表达水平都伴随着I/R过程增加。已有相关研究同样观察到，大鼠肾I/R后炎症因子表达增加[18]。
Notch1信号通路存在于多种动物体内，影响机体的发育和细胞分化、增殖、凋亡等，并参与多种疾病的发生和发展[19-20]，与肾脏炎症级联反应增加具有密切关系[21]。本文的研究结果也表明，LC能够改善I/R肾功能和肾组织的形态变化，而这些保护作用可能通过调节Notch1信号通路活化实现的。首先，Notch1信号通路蛋白Notch1和Jagged1的表达水平在I/R组中表达显著上调，而已有研究表明Notch1信号激活能够加剧I/R的损伤[22]。本研究结果则显示，LC腹腔注射能够明显抑制I/R导致的Notch1和Jagged1的上调，当使用Notch1信号通路激活剂rhNF-κB时，LC的作用明显被削弱。其次，I/R肾组织中IL-6和TNF-α的mRNA和蛋白表达同样被LC所抑制，LC的作用也可被rhNF-κB部分逆转。表明LC也可能通过抑制Notch1信號减弱I/R的炎性损伤。
由于雄性激素更容易使肾脏受到I/R侵害，因此本研究采用雄性大鼠作为实验对象[23]。而本实验对肾I/R大鼠的研究表明，I/R增加了Scr和BUN的水平，加重了肾组织学损伤。另外，I/R增加了肾组织Caspase3和Bax/Bcl-2的表达，通过HE染色也观察到细胞体积缩小、细胞核固缩、碎裂等凋亡特征，这表明I/R能够诱导更多肾组织细胞凋亡。LIU等[24]观察到I/R对大鼠肾脏的损伤特征与本研究结果一致。值得注意的是，LC注射后I/R组的肾脏组织形态具有明显的改善，与此同时I/R组大鼠中血BUN和Scr的高水平及肾组织中的凋亡标记物Caspase3和Bax/Bcl-2都被LC所抑制。已有研究结果表明，LC对系膜细胞、神经元细胞中的Caspase3和Bax/Bcl-2水平具有同样的调节作用[25-26]。而且Notch1信号被敲低后可以抑制足细胞的Bcl-2依赖性凋亡[27]。而本研究反向验证中使用rhNF-κB激活Notch1信号通路后，LC对肾组织Caspase3和Bax/Bcl-2的抑制作用被减弱。以上研究结果表明，LC通过抑制Notch1信号可能减弱I/R肾组织的Caspase3和Bax/Bcl-2依赖的细胞凋亡。
方法 雄性SD大鼠随机分为假手术组、I/R组、川芎素组（10 μmol/kg腹腔注射，LC组）、LC+Notch1通路激活剂rhNF-κB组（LC+rhNF-κB组），每组15只。观察各组血尿素氮（BUN）和血清肌酐（Scr）水平，采用实时定量PCR（qRT-PCR）和蛋白免疫印迹（Western blot）方法检测肾组织肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素-6（IL-6）的mRNA和蛋白表达水平，免疫组化和Western blot检测肾组织Caspase3、Bax/Bcl-2、Notch1、Jagged1的表达水平。
结果 I/R组肾组织结构严重破坏，BUN、Scr、TNF-α、IL-6、Caspase3、Bax/Bcl-2、Notch1、Jagged1的表达均显著高于假手术组（P均<0.05），而LC组中上述蛋白的表达均显著低于I/R组（P均<0.05）。另外，LC+rhNF-κB组中BUN、Scr、TNF-α、IL-6、Caspase3、Bax/Bcl-2的表达与LC组相比均显著上调（P均<0.05）。
结论 川芎素通过抑制Notch1活化抑制肾组织的损伤和炎症反应。
[关键词] 再灌注损伤;急性肾损伤;川芎嗪;受体，Notch1;炎症;大鼠，Sprague-Dawley
[中图分类号] R619.9
[文献标志码] A
[文章编号] 2096-5532（2021）05-0725-06
doi：10.11712/jms.2096-5532.2021.57.172
[开放科学（资源服务）标识码（OSID）]
[网络出版] https：//kns.cnki.net/kcms/detail/37.1517.R.20211101.0853.001.html;2021-11-01 11：51：01
ROLE OF SODIUM FERULATE IN ISCHEMIA-REPERFUSION INJURY IN RATS AND ITS MECHANISM
JIANG Xin， QU Qingshan， LIANG Shaofeng， FANG Jun， SUN Dong
（Department of Organ Transplantation， Zhengzhou People’s Hospital， Zhengzhou 450000， China）
[ABSTRACT] Objective To investigate the protective effect of sodium ferulate against renal ischemia-reperfusion （I/R） injury in rats and its mechanism.
Methods Male Sprague-Dawley rats were randomly divided into sham-operation group， I/R group， sodium ferulate group （10 μmol/kg by intraperitoneal injection）， and sodium ferulate+Notch1 pathway activator rhNF-κB group （sodium ferulate+rhNF-κB group）， with 15 rats in each group. The levels of blood urea nitrogen （BUN） and serum creatinine （Scr） were observed for each group; quantitative real-time PCR and Western blot were used to measure the mRNA and protein expression levels of tumor necrosis factor-α （TNF-α） and interleukin-6 （IL-6） in renal tissue; immunohistochemistry and Western blot were used to measure the expression levels of Caspase3， Bax/Bcl-2， Notch1， and Jagged1 in renal tissue.
Results
Compared with the sham-operation group， the I/R group had severe structural damage of renal tissue and significantly higher expression levels of BUN， Scr， TNF-α， IL-6， Caspase3， Bax/Bcl-2， Notch1， and Jagged1 （all P<0.05）， and the sodium ferulate group had significantly lower expression levels of the above proteins than the I/R group （all P<0.05）. In addition， compared with the sodium ferulate group， the sodium ferulate+rhNF-κB group had significantly upregulated expression levels of BUN， Scr， TNF-α， IL-6， Caspase3， and Bax/Bcl-2 （all P<0.05）. Conclusion Sodium ferulate inhibits renal tissue injury and inflammation by inhibiting the activation of Notch1.
[KEY WORDS] reperfusion injury; acute kidney injury; Tetramethylpyrazine; receptor， Notch1; inflammation; rats， Sprague-Dawley
肾脏缺血再灌注损伤（I/R）是引起急性肾损伤（AKI）的主要病因[1]。AKI和肾I/R均导致肾功能迅速下降[2-3]，但目前缺乏预防或治疗AKI的有效策略[3]。肾I/R发展过程涉及活性氧（ROS）的产生、促炎症反应和细胞死亡等[4-7]，且导致肾小管上皮细胞的损伤[8-9]。细胞凋亡是肾脏I/R中肾小管上皮细胞死亡的主要类型[10]。长期以来川芎一直被应用于心血管疾病的治疗，如卒中[11]和冠心病[12]，特別是在我国、日本和韩国应用广泛[13]。已有研究结果表明，川芎素（LC）可以保护急性缺血性肾损伤[14]，而鲜见其对缺血后再灌注肾损伤保护作用的研究。因此，本研究的目的是探讨LC对大鼠肾I/R的保护作用，并探讨Notch通路对大鼠肾脏I/R中介导的炎症反应和细胞凋亡的作用及其可能机制，为LC作为治疗肾脏I/R的新策略提供数据支持。现将结果报告如下。
1 材料和方法
1.1 实验材料
1.1.1 实验动物 选择健康雄性、SPF级Sprague-Dawley（SD）大鼠60只，体质量211～248 g，购于我院实验动物中心，饲养于SPF级动物实验室，动物自由饮食、饮水。本研究严格遵守《实验动物护理和使用指南》的执行原则。
1.1.2 主要试剂及药物 LC购于中国河北安国神农中草药公司;兔抗大鼠的肿瘤坏死因子α（TNF-α）（ab6671）、白细胞介素-6（IL-6）（ab208113）、半胱天冬酶3（Caspase3）（ab13847）、B细胞淋巴瘤/白血病相关X的蛋白（BAX）（ab32503）、B细胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）（ab196495）、缺口蛋白1（Notch1）（ab52301）、锯齿状蛋白1（Jagged1）（ab233101）的第一抗体、辣根过氧化物酶（HRP）标记山羊抗兔第二抗体（ab6721）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH，ab9485）等均购于美国Abcam公司;SYBR Green qPCR Master Mix试剂购于MedChemExpress公司;组织蛋白抽提试剂购自上海碧云天生物科技有限公司。血清肌酐（Scr）和尿素氮（BUN）试剂盒购于美国R&D Systems公司。
1.2 实验方法
1.2.1 实验分组 取雄性SD大鼠60只，适应性喂养1周后，随机分为假手术组（a组）、I/R组（b组）、LC组（c组）和LC+Notch1通路激活剂rhNF-κB组（LC+rhNF-κB组，d组），每组15只。
1.2.2 模型建立及标本采集 大鼠术前禁食8 h，不禁水，100 g/L水合氯醛（3.5 mL/kg）腹腔注射麻醉。常规固定、消毒、铺巾，腹正中切口，游离肾蒂，I/R组以无创小血管夹同时夹闭双侧肾蒂50 min，之后松开血管夹，让血流再通。假手术组、LC组、LC+rhNF-κB组大鼠手术方式与I/R组相同，但假手术组不用血管夹阻断血流，而LC组、LC+rhNF-κB组在松开血管夹时予LC（10 μmol/kg）腹腔注射，I/R组与假手术组则以等量生理盐水注射液腹腔注射。各组分别于再灌注6、12、24、48 h共4个时点取血标本（腹主动脉穿刺），在48 h取肾脏组织标本。右肾用冰生理盐水冲洗后置液氮保存，行实时定量PCR（qRT-PCR）和蛋白免疫印迹（Western blot）检测;左肾用40 g/L甲醛固定缓冲液固定，待制备石蜡切片。
1.2.3 酶联免疫吸附（ELISA）检测 将血清保存在-80 ℃冰箱，通过ELISA试剂盒检测血清肌酐（Scr）和血尿素氮（BUN）水平。
1.2.4 苏木精-伊红（HE）和免疫组织化学染色 按照HE染色试剂盒说明将5 μm肾组织石蜡切片进行HE染色。使用常规免疫组织化学法（IHC）检测Notch1在肾脏组织表达，Notch1抗体的稀释度为1∶100。使用GTVsionTM Ⅲ检测系统（GK5007，Gene Tech，中国）记录所有IHC图像。
1.2.5 qRT-PCR检测 按照TianGen试剂盒说明书步骤提取大鼠肾组织总RNA，并按照TAKARA（RR047A）试剂盒说明进行反转录。参照SYBR Green Master Mix PCR试剂盒说明进行qPCR扩增，所用引物及其序列见表1。以人GAPDH基因作为内参照，采用2-ΔΔCT法计算IL-6和TNF-α的mRNA相对表达量。
1.2.6 Western blot检测 按照RIPA裂解缓冲液试剂盒说明书提取肾脏组织的总蛋白，并使用BCA试剂盒检测浓度。蛋白经过SDS-PAGE电泳和转膜操作后，分别孵育TNF-α（1∶600）、IL-6（1∶600）、Caspase3（1∶500）、Bax（1∶800）、Bcl-2（1∶400）、Notch1（1∶500）和Jagged1（1∶500）抗体和对应的二抗。蛋白条带显色后，用Image J软件分析比较目的条带/内参照（GAPDH）条带灰度值。
1.3 统计学处理
应用SPSS 20.0统计软件对数据进行处理分析。其中计量资料数据采用±s的形式表示，两组均数的比较采用两独立样本比较的t检验;多组间的均数比较采用单因素方差分析，均数两两之间的比较采用Bonferroni法。以P<0.05为差异有统计学意义。 2 结 果
2.1 I/R模型大鼠肾脏结构和功能变化
HE染色结果显示，假手术组大鼠肾脏结构无明显形态学改变;而与假手术组相比，I/R组的肾组织结构出现严重破坏，包括肾小管扩张、肾上皮细胞扁平、刷状缘丧失和核染色丧失等（图1A）。另外，I/R组大鼠血BUN和Scr水平在12、24和48 h等3个时间点均明显高于假手术组，差异均有显著性（t=10.532～17.693，P均<0.05）。见图1B。
2.2 LC对I/R大鼠肾组织结构和Notch1信号通路的影响
HE染色结果显示，与I/R组相比，LC组破坏的肾组织的结构有明显恢复;与I/R+LC组相比，I/R+LC+rhNF-κB组的肾组织结构破坏又加重。见图2A。肾组织中的Notch1和Jagged1表达检测结果显示，4组Notch1和Jagged1的均数差异有统计学意义（F=256.311、189.106，P均<0.05）。两两比较的结果显示，与假手术组相比较，I/R组中Notch1和Jagged1在肾组织中表达上调（P均<0.05）;与I/R组相比， LC组Notch1和Jagged1的表达下调（P均<0.05）;使用Notch1信号激活剂rhNF-κB处理后与LC组相比，LC+rhNF-κB组的Notch1和Jagged1的表达明显恢复（P均<0.05），见图2B～E。另外，4组的BUN、Scr均数差异有统计学意义（F=182.060、183.772，P均<0.05）。两两比较结果显示，与I/R组相比，在LC组中BUN、Scr水平降低（P均<0.05）;但是与LC组相比较，LC+rhNF-κB组的BUN、Scr水平又增加，但并未超过I/R组，差异均有统计学意义（P均<0.05）。见图2F。
2.3 LC对I/R大鼠肾脏炎症相关指标表达的影响
本文4组肾脏组织IL-6和TNF-α的mRNA表达差别有显著意义（F=203.012、214.310，P均<0.05）。两两比较结果显示，与假手术组相比，I/R组肾脏组织IL-6和TNF-α的mRNA表达升高（P均<0.05）;而与I/R组相比，LC组肾脏组织IL-6和TNF-α的mRNA表达水平降低（P均<0.05）;但是LC+rhNF-κB组IL-6和TNF-α的mRNA表达部分恢复（P均<0.05）。见图3A、B。4组大鼠肾脏组织IL-6和TNF-α的蛋白表达水平差异有显著意义（F=113.412、128.204，P均<0.05）。两两比较结果显示，与假手术组相比，I/R组肾脏组织IL-6和TNF-α的蛋白表达水平升高（P均<0.05）;而与I/R组相比，LC组肾脏组织IL-6和TNF-α的蛋白表达水平降低（P均<0.05）;但是LC+rhNF-κB组IL-6和TNF-α的蛋白表达水平部分恢复（P均<0.05）。见图3C～F。
2.4 LC对I/R大鼠肾脏细胞凋亡相关标志物表达的影响
本文4组Caspase3和Bax/Bcl-2表达差别有统计学意义（F=156.205、143.337，P均<0.05）。两两比较结果显示，Caspase3和Bax/Bcl-2在I/R组的表达均高于假手术组（P均<0.05），而二者在LC组的表达均低于I/R组（P均<0.05），二者在LC+rhNF-κB组大鼠肾组织表达均高于LC组（P均<0.05）。见图4A～C。
3 讨 论
AKI是一种潜在的致命疾病，病人死亡率高。肾脏I/R是AKI的主要原因[15]。有研究显示，当肾动脉灌注压力处于10.64～23.94 kPa范围时，肾血流将随着灌注压力的变化相应地变化。但是，当灌注压力低于10.64 kPa时，肾血流量急剧降低，形成缺血并造成不可逆性损伤[16]。不幸的是，唯一合适的治疗方法是肾移植和肾透析。因此，迫切需要找到一种有效的药物来预防或者治疗I/R。LC可能对AKI具有保护作用，但是否能够改善肾I/R仍不明确。因此，我们分析了在体内LC对肾I/R大鼠的影响。结果表明，LC可通过抑制Notch1活化，抑制I/R大鼠的肾组织损伤和炎症反应，从而发挥肾脏保护作用。
炎症反应增强是肾I/R的另一个明显的特征，I/R可以引发肾脏炎性细胞增多、促炎性因子（如TNF-α、IL-1β、IL-6等）的水平升高以及黏附分子增加，这些因子共同作用激发炎症的级联反应，放大局部炎症反应，甚至引起器官损伤[17]。本研究检测肾I/R后肾组织中IL-6和TNF-α的mRNA和蛋白表达水平，结果表明，无论在血清中还是在肾脏组织中炎症因子的表达水平都伴随着I/R过程增加。已有相关研究同样观察到，大鼠肾I/R后炎症因子表达增加[18]。
Notch1信号通路存在于多种动物体内，影响机体的发育和细胞分化、增殖、凋亡等，并参与多种疾病的发生和发展[19-20]，与肾脏炎症级联反应增加具有密切关系[21]。本文的研究结果也表明，LC能够改善I/R肾功能和肾组织的形态变化，而这些保护作用可能通过调节Notch1信号通路活化实现的。首先，Notch1信号通路蛋白Notch1和Jagged1的表达水平在I/R组中表达显著上调，而已有研究表明Notch1信号激活能够加剧I/R的损伤[22]。本研究结果则显示，LC腹腔注射能够明显抑制I/R导致的Notch1和Jagged1的上调，当使用Notch1信号通路激活剂rhNF-κB时，LC的作用明显被削弱。其次，I/R肾组织中IL-6和TNF-α的mRNA和蛋白表达同样被LC所抑制，LC的作用也可被rhNF-κB部分逆转。表明LC也可能通过抑制Notch1信號减弱I/R的炎性损伤。
由于雄性激素更容易使肾脏受到I/R侵害，因此本研究采用雄性大鼠作为实验对象[23]。而本实验对肾I/R大鼠的研究表明，I/R增加了Scr和BUN的水平，加重了肾组织学损伤。另外，I/R增加了肾组织Caspase3和Bax/Bcl-2的表达，通过HE染色也观察到细胞体积缩小、细胞核固缩、碎裂等凋亡特征，这表明I/R能够诱导更多肾组织细胞凋亡。LIU等[24]观察到I/R对大鼠肾脏的损伤特征与本研究结果一致。值得注意的是，LC注射后I/R组的肾脏组织形态具有明显的改善，与此同时I/R组大鼠中血BUN和Scr的高水平及肾组织中的凋亡标记物Caspase3和Bax/Bcl-2都被LC所抑制。已有研究结果表明，LC对系膜细胞、神经元细胞中的Caspase3和Bax/Bcl-2水平具有同样的调节作用[25-26]。而且Notch1信号被敲低后可以抑制足细胞的Bcl-2依赖性凋亡[27]。而本研究反向验证中使用rhNF-κB激活Notch1信号通路后，LC对肾组织Caspase3和Bax/Bcl-2的抑制作用被减弱。以上研究结果表明，LC通过抑制Notch1信号可能减弱I/R肾组织的Caspase3和Bax/Bcl-2依赖的细胞凋亡。