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摘 要：建立反相高效液相色谱法测定颈痛颗粒中阿魏酸的含量。方法：采用奥泰公司 C18 色谱柱（250 mm×4.6mm，5μm），甲醇-水-冰醋酸（30∶69∶1），检测波长为320nm，流速为1.0ml/min，柱温为30℃。阿魏酸在8～80μg·mL-1范围内呈良好的线性关系。阿魏酸平均回收率分别为99.6%。结论：本法简便、准确，可用于颈痛颗粒中阿魏酸的含量测定。
关键词：颈痛颗粒；含量；测定
颈痛颗粒具有活血化瘀，行气止痛的功效。颈痛颗粒用于神经根型颈椎病属血瘀气滞、脉络闭阻证。颈痛颗粒由三七、羌活、白芍、川芎、延胡索、威灵仙、葛根、糊精组成。川芎主产于四川（灌县），在云南、贵州、广西等地，常用于活血行气，祛风止痛。《别录》记载：“除脑中冷动，面上游风去来，目泪出，多涕唾，忽忽如醉，诸寒冷气，心腹坚痛，中恶，卒急肿痛，胁风痛，温中内寒。”川芎含有川芎嗪（chuanxiongzine）、黑麦草碱、川咖啡酸（coffeic acid）、阿魏酸（ferulic acid），大黄酚（chrysophanic acid）、新川芎内酯（neocin-dilide）、洋川芎内酯（senkyunolide）、洋川芎内酯（senkyunolide）B、洋川芎醌（senkyunone）、香草酸（vanillic acid）、芎萘呋内酯（wallichilide）、L-缬氨酰-L-缬氨酸酐（L-valyl-L-valinc achydride）、川芎酚，脲嘧啶（uracil）、棕榈酸（palmitic acid）、β-谷甾醇（β-sitosterol）等。本文采用高效液相法对颈痛颗粒中的阿魏酸的进行了含量测定。
1仪器与试药
1.1仪器：天瑞仪器LC-310液相色谱（江苏天瑞仪器股份有限公司）；瑞士梅特勒-托利多MS精密天平（梅特勒-托利多中国公司）；Cascada III.I全新智能纯水/超纯水一体化系统（颇尔过滤器（北京）有限公司）；天瑞仪器LC-310液相色谱（江苏天瑞仪器股份有限公司）；KQ-300VDE型双频数控超声波清洗器；TU-1901 双光束紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）。
1.2色谱柱：奥泰公司 C18 色谱柱（250 mm×4.6mm，5μm）。
1.3对照品：阿魏酸 购自中国药品生物制品检定所。
1.4试剂：甲醇（上海埃彼化学试剂有限公司）、冰醋酸（上海埃彼化学试剂有限公司）、乙酸乙酯（上海埃彼化学试剂有限公司）、乙腈（上海埃彼化学试剂有限公司）。
1.5试药：颈痛颗粒
2测定方法确定
2.1色谱条件
依据查阅文献及考查的结果，确定色谱条件如下。流动相：甲醇-水-冰醋酸（30∶69∶1），检测波长：320nm，流速：1.0m·min-1。柱温：35℃。理论板数按阿魏酸峰计算应不得低于3000。
2.2对照品溶液的制备
精密称取阿魏酸对照品适量，置棕色容量瓶中，加甲醇制成每1mL含20μg的溶液，即得。
2.3提取方法确定
2.3.1提取溶媒的选择
在供试品溶液制备中，分别选用了水饱合的乙酸乙酯、乙醇、50%甲醇进行热回流提取，结果表明水饱合的乙酸乙酯分离效果、峰形及含量为最好，所以选择水饱合的乙酸乙酯进行热回流提取。
2.3.2提取时間的选择
取供试品适量，用水饱合的乙酸乙酯提取，热回流提取分别提取20、40、60分钟，制备供试品溶液，含量结果表明：三种提取时间结果无明显差异，采用热回流提取20分钟。
2.3.3供试品溶液的制备
取供试品精密称定，精密称取0.5g，精密加入水饱合的乙酸乙酯50mL，热回流提取20分钟，过滤，水浴蒸干，残渣用5ml甲醇溶解，摇匀，滤过。取续滤液，即得。
2.4专属性试验
依照处方取三七、羌活、白芍、延胡索、威灵仙、葛根、糊精，按样品制备工艺制成阴性对照样品，依上述方法测定，结果在阿魏酸出峰处阴性液无色谱峰，结果表明本方法专属性良好。
2.5精密度试验
精密称取阿魏酸对照品适量，加甲醇使溶解，制成浓度为20μg·mL-1的供试品溶液。照上述色谱条件，精密吸取10μl，连续进样6次，记录峰面积。结果，RSD=0.85%，表明本方法精密度良好。
2.6对照品的线性考察
精密称取阿魏酸对照品10.0mg，置25ml棕色容量瓶中，加入甲醇溶液使溶解并稀释至刻度，摇匀，分别精密吸取0.2、0.4、0.6、1.2、1.6、2.0mL，置于10mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀。分别精密上述溶液吸取10μL，注人液相色谱仪，依照2.1项下的色谱条件测定，记录色谱峰。以峰面积（Y）为纵坐标，对照品进样量（X）为横坐标，绘制标准曲线，计算回归方程。结果表明，阿魏酸在8～80μg·mL-1范围内呈良好的线性关系。
2.7重现性试验
称取同一批的颈痛颗粒样品6份，按测定方法项下的方法制备供试品溶液，测定含量，并计算样品的RSD值，结果RSD为0.77%，结果表明此方法的重现性良好。
2.8准确度试验
精密称取已知含量的样品6份，分别加入一定量的阿魏酸对照品，上述方法进行测定，计算回收率，平均回收率分别为99.6%，RSD为0.76%。
2.9样品稳定性试验
取同一批颈痛颗粒样品，按2.3项下的供试品制备方法制备供试品，将供试品置棕色瓶中室温下放置，分别于第0、2、4、6小时，精密吸取供试品溶液10μl 注入液相色谱仪中，记录色谱图。测定颈痛颗粒中阿魏酸的RSD=0.93%。结果表明供试品6小时内稳定。
3讨论
分别考察甲醇-水-冰醋酸（33∶66∶1），0.025mol/L磷酸二氢铵溶液（以磷酸调节pH=2.9）-乙腈（60：40），甲醇-水-冰醋酸（30∶69∶1），乙腈-水-冰醋酸（33∶66∶1）不同比例的流动相，结果以甲醇-水-冰醋酸（30∶69∶1）为流动相，供试品各峰分离效果最好，故选用，甲醇-水-冰醋酸（30∶69∶1）为流动相。本实验表明此方法可用于颈痛颗粒中阿魏酸的含量测定。
参考文献：
[1]张宁，李煜，董桂贤，王泉，李明艳，林永胜，刘玉民.颈痛颗粒联合牵引治疗神经根型颈椎病38例疗效观察[J].河北中医. 2011（11）
[2]张嫱，徐传彬，刘杰，江玉娟，潘瑞雪，吴维群，吴世德.HPLC法测定颈痛颗粒中阿魏酸的含量[J].食品与药品.2017（01）
[3]席海为，马强，李强，雷海民.HPLC同时测定都梁滴丸中的阿魏酸、5-甲氧基补骨脂素、欧前胡素、异欧前胡素[J].中国实验方剂学杂志.2011（16）
[4]尚刚伟，蒋永培，黄熙，樊亚萱，梅其柄，何仲贵.RP-HPLC测定正常人口服复方川芎汤剂后血清中游离的阿魏酸[J].中国药学杂志.1997（12）
[5]叶会呈，叶其馨，王带媚，曾丽云.HPLC法测定血府逐瘀汤中阿魏酸的含量[J].中药新药与临床药理.2009（04）
[6]梁光义，徐必学，李霞，曹佩雪.高效液相色谱法测定当归补血汤分煎液与合煎液中阿魏酸含量[J].中成药.2003（02）
关键词：颈痛颗粒；含量；测定
颈痛颗粒具有活血化瘀，行气止痛的功效。颈痛颗粒用于神经根型颈椎病属血瘀气滞、脉络闭阻证。颈痛颗粒由三七、羌活、白芍、川芎、延胡索、威灵仙、葛根、糊精组成。川芎主产于四川（灌县），在云南、贵州、广西等地，常用于活血行气，祛风止痛。《别录》记载：“除脑中冷动，面上游风去来，目泪出，多涕唾，忽忽如醉，诸寒冷气，心腹坚痛，中恶，卒急肿痛，胁风痛，温中内寒。”川芎含有川芎嗪（chuanxiongzine）、黑麦草碱、川咖啡酸（coffeic acid）、阿魏酸（ferulic acid），大黄酚（chrysophanic acid）、新川芎内酯（neocin-dilide）、洋川芎内酯（senkyunolide）、洋川芎内酯（senkyunolide）B、洋川芎醌（senkyunone）、香草酸（vanillic acid）、芎萘呋内酯（wallichilide）、L-缬氨酰-L-缬氨酸酐（L-valyl-L-valinc achydride）、川芎酚，脲嘧啶（uracil）、棕榈酸（palmitic acid）、β-谷甾醇（β-sitosterol）等。本文采用高效液相法对颈痛颗粒中的阿魏酸的进行了含量测定。
1仪器与试药
1.1仪器：天瑞仪器LC-310液相色谱（江苏天瑞仪器股份有限公司）；瑞士梅特勒-托利多MS精密天平（梅特勒-托利多中国公司）；Cascada III.I全新智能纯水/超纯水一体化系统（颇尔过滤器（北京）有限公司）；天瑞仪器LC-310液相色谱（江苏天瑞仪器股份有限公司）；KQ-300VDE型双频数控超声波清洗器；TU-1901 双光束紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）。
1.2色谱柱：奥泰公司 C18 色谱柱（250 mm×4.6mm，5μm）。
1.3对照品：阿魏酸 购自中国药品生物制品检定所。
1.4试剂：甲醇（上海埃彼化学试剂有限公司）、冰醋酸（上海埃彼化学试剂有限公司）、乙酸乙酯（上海埃彼化学试剂有限公司）、乙腈（上海埃彼化学试剂有限公司）。
1.5试药：颈痛颗粒
2测定方法确定
2.1色谱条件
依据查阅文献及考查的结果，确定色谱条件如下。流动相：甲醇-水-冰醋酸（30∶69∶1），检测波长：320nm，流速：1.0m·min-1。柱温：35℃。理论板数按阿魏酸峰计算应不得低于3000。
2.2对照品溶液的制备
精密称取阿魏酸对照品适量，置棕色容量瓶中，加甲醇制成每1mL含20μg的溶液，即得。
2.3提取方法确定
2.3.1提取溶媒的选择
在供试品溶液制备中，分别选用了水饱合的乙酸乙酯、乙醇、50%甲醇进行热回流提取，结果表明水饱合的乙酸乙酯分离效果、峰形及含量为最好，所以选择水饱合的乙酸乙酯进行热回流提取。
2.3.2提取时間的选择
取供试品适量，用水饱合的乙酸乙酯提取，热回流提取分别提取20、40、60分钟，制备供试品溶液，含量结果表明：三种提取时间结果无明显差异，采用热回流提取20分钟。
2.3.3供试品溶液的制备
取供试品精密称定，精密称取0.5g，精密加入水饱合的乙酸乙酯50mL，热回流提取20分钟，过滤，水浴蒸干，残渣用5ml甲醇溶解，摇匀，滤过。取续滤液，即得。
2.4专属性试验
依照处方取三七、羌活、白芍、延胡索、威灵仙、葛根、糊精，按样品制备工艺制成阴性对照样品，依上述方法测定，结果在阿魏酸出峰处阴性液无色谱峰，结果表明本方法专属性良好。
2.5精密度试验
精密称取阿魏酸对照品适量，加甲醇使溶解，制成浓度为20μg·mL-1的供试品溶液。照上述色谱条件，精密吸取10μl，连续进样6次，记录峰面积。结果，RSD=0.85%，表明本方法精密度良好。
2.6对照品的线性考察
精密称取阿魏酸对照品10.0mg，置25ml棕色容量瓶中，加入甲醇溶液使溶解并稀释至刻度，摇匀，分别精密吸取0.2、0.4、0.6、1.2、1.6、2.0mL，置于10mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀。分别精密上述溶液吸取10μL，注人液相色谱仪，依照2.1项下的色谱条件测定，记录色谱峰。以峰面积（Y）为纵坐标，对照品进样量（X）为横坐标，绘制标准曲线，计算回归方程。结果表明，阿魏酸在8～80μg·mL-1范围内呈良好的线性关系。
2.7重现性试验
称取同一批的颈痛颗粒样品6份，按测定方法项下的方法制备供试品溶液，测定含量，并计算样品的RSD值，结果RSD为0.77%，结果表明此方法的重现性良好。
2.8准确度试验
精密称取已知含量的样品6份，分别加入一定量的阿魏酸对照品，上述方法进行测定，计算回收率，平均回收率分别为99.6%，RSD为0.76%。
2.9样品稳定性试验
取同一批颈痛颗粒样品，按2.3项下的供试品制备方法制备供试品，将供试品置棕色瓶中室温下放置，分别于第0、2、4、6小时，精密吸取供试品溶液10μl 注入液相色谱仪中，记录色谱图。测定颈痛颗粒中阿魏酸的RSD=0.93%。结果表明供试品6小时内稳定。
3讨论
分别考察甲醇-水-冰醋酸（33∶66∶1），0.025mol/L磷酸二氢铵溶液（以磷酸调节pH=2.9）-乙腈（60：40），甲醇-水-冰醋酸（30∶69∶1），乙腈-水-冰醋酸（33∶66∶1）不同比例的流动相，结果以甲醇-水-冰醋酸（30∶69∶1）为流动相，供试品各峰分离效果最好，故选用，甲醇-水-冰醋酸（30∶69∶1）为流动相。本实验表明此方法可用于颈痛颗粒中阿魏酸的含量测定。
参考文献：
[1]张宁，李煜，董桂贤，王泉，李明艳，林永胜，刘玉民.颈痛颗粒联合牵引治疗神经根型颈椎病38例疗效观察[J].河北中医. 2011（11）
[2]张嫱，徐传彬，刘杰，江玉娟，潘瑞雪，吴维群，吴世德.HPLC法测定颈痛颗粒中阿魏酸的含量[J].食品与药品.2017（01）
[3]席海为，马强，李强，雷海民.HPLC同时测定都梁滴丸中的阿魏酸、5-甲氧基补骨脂素、欧前胡素、异欧前胡素[J].中国实验方剂学杂志.2011（16）
[4]尚刚伟，蒋永培，黄熙，樊亚萱，梅其柄，何仲贵.RP-HPLC测定正常人口服复方川芎汤剂后血清中游离的阿魏酸[J].中国药学杂志.1997（12）
[5]叶会呈，叶其馨，王带媚，曾丽云.HPLC法测定血府逐瘀汤中阿魏酸的含量[J].中药新药与临床药理.2009（04）
[6]梁光义，徐必学，李霞，曹佩雪.高效液相色谱法测定当归补血汤分煎液与合煎液中阿魏酸含量[J].中成药.2003（02）