【摘 要】
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随着植物转基因研究的不断深入,单个基因转化植物的局限与不足逐渐凸显出来.多基因转化策略以其诸多优势,必将成为今后基因工程在基础理论与实际应用研究中的一个重要方
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随着植物转基因研究的不断深入,单个基因转化植物的局限与不足逐渐凸显出来.多基因转化策略以其诸多优势,必将成为今后基因工程在基础理论与实际应用研究中的一个重要方向.而单个载体携带多个拥有独立ORF的基因对植物进行转化的转化方式凭借其相对简单、高效、后代不发生重组与分离等优点,将是实现多基因转化的主要方法.但由于技术条件限制,能携带多个基因载体的构建仍比较困难.以往采用普通酶切、连接、gateway技术、Cre/LoxP重组等方法构建载体,存在回避酶切位点、步骤较多、操作过程比较复杂、成本偏高,需要特殊载体与菌种等问题. 利用本载体系统中克隆载体与植物表达载体上同尾酶位点连接后原有酶切位点消失原理,建立了一种新型多基因植物转化载体系统p209/p6435x.采用了Not I/Bsp120 I与Spe I/Xba I/Nhe I两个不同的同尾酶系统,使用本载体系统,只需要常规的酶切与连接即可将一般的的外源基因不断连入转化载体中.本实验采用该载体将大肠杆菌(Escherichia coli str.K-12 substr.DH10B)甘露醇-1-磷酸脱氢酶(mtlD)、6-磷酸山梨醇脱氢酶(strD)、胆碱脱氢酶(betA)、海藻糖-6-磷酸合成酶及海藻糖-6-磷酸磷酸酯酶(ostBA),Na+/H+反向转运输体A(nhaA)等目的基因的开放阅读框(ORF)依次连入植物转化载体p209中,构建成功携带5个外源基因的多基因植物转化载体,并通过农杆菌介导转化烟草成功.本载体系统与其它构建多基因转化载体方法相比,简化了操作步骤,降低了实验难度,技术成熟可靠、成本低廉,为多基因转化载体的构建提供一条新的途径.
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