【摘 要】
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目的 探讨在低频超声辐照下,纳米微泡介导小干扰RNA(siRNA)在体外肿瘤细胞中的转染效能以及通过抗肿瘤凋亡相关基因的siRNA在诱导肿瘤凋亡中的应用.方法 ①利用采用薄膜-水化,声震法制备脂质微泡造影剂,并通过多次离心分离纯化最终得到纳米级微泡造影剂.利用聚合物(PEG-PL)将siRNA修饰成为带正电的胶束,再与带负电的微泡造影剂复合形成微泡-siRNA复合物.②利用动态光散射(DLS)法测
【机 构】
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中山大学附属第三医院超声科,中山大学超声诊断与介入超声研究所,广州,510630
【出 处】
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1st International Symposium on Ultrasound Molecular Imaging
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目的 探讨在低频超声辐照下,纳米微泡介导小干扰RNA(siRNA)在体外肿瘤细胞中的转染效能以及通过抗肿瘤凋亡相关基因的siRNA在诱导肿瘤凋亡中的应用.方法 ①利用采用薄膜-水化,声震法制备脂质微泡造影剂,并通过多次离心分离纯化最终得到纳米级微泡造影剂.利用聚合物(PEG-PL)将siRNA修饰成为带正电的胶束,再与带负电的微泡造影剂复合形成微泡-siRNA复合物.②利用动态光散射(DLS)法测定复合物粒径大小、Zeta电位,采用扫描电镜(SEM)观察微泡大小、形态.③通过低频超声辐照,将用FITC标记的siRNA递送到肿瘤细胞内,然后利用流式细胞计数评价siRNA转染效能,通过激光共聚焦显微镜观察siRNA在细胞内的分布.④将抗肿瘤凋亡相关基因Bcl-2的siRNA转染到肿瘤细胞内,通过实时荧光定量PCR (RT-qPCR)和Western blot分别从基因水平(mRNA)、蛋白水平定量检测Bcl-2及其下游蛋白Caspase-3的表达；利用TUNEL实验验证肿瘤细胞的凋亡情况.结果 ①所制备的纳米级微泡造影剂粒径为(476.0±6.1)nm,表面电位(15.3±2.7) mV；扫描电镜观测微泡-siRNA聚合物大小均匀,表面呈球状,未见明显聚集.②流式细胞计数检测发现低频超声辐照下siRNA的转染率为50.3％,明显高于非超声辐照组的5.0％(P＜0.001)；激光共聚焦显微镜纤维FITC标记的siRNA主要分布在肿瘤细胞的胞浆内,超声辐照组FITC的荧光分布明显广于非超声辐照组,且荧光强度也较非超声辐照组强.③将Bcl-2 siRNA转染到肿瘤细胞内后,RT-qPCR结果显示Bcl-2的mRNA表达受到明显抑制,抑制率为82％；Western blot结果表明肿瘤细胞的Bcl-2蛋白表达量明显较非超声辐照组及空白对照组高,而其下游凋亡执行蛋白Caspase-3表达量明显增加.TUNEL实验结果显示超声辐照纳米微泡介导的Bcl-2 siRNA转染能够诱导肿瘤细胞发生细胞凋亡.结论 成功制备小粒径纳米级脂质微泡-siRNA复合物,在体外低频超声辐照下能够有效促进siRNA的转染.将抑制肿瘤凋亡相关基因Bcl-2的siRNA转染到肿瘤细胞内,抑制Bcl-2的表达,从而促进其下游的凋亡执行蛋白Caspase-3的表达,进而有效促进肿瘤细胞的凋亡.纳米级微泡作为一种新型的siRNA载体,能够实现对靶细胞的有效siRNA转染,为肿瘤的基因治疗提出一种新的思路.
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