【摘 要】
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目的 本实验通过研究肝癌细胞和caf 的工具细胞(肝星状细胞,LX2)共培养后LX2 细胞中miRNA表达谱的改变,筛选并验证出具特征性改变的miRNA,并探究这种变化对肝癌细胞功能的影响及相关机制方法 利用caf 的工具细胞(LX2 细胞株)和3 种不同肝癌细胞株通过体外共培养体系建立癌相关成纤维细胞模型,并利用miRNA 芯片检测分析其miRNA 谱.结合不同筛选方法,筛选出癌相关成纤维细胞异
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目的 本实验通过研究肝癌细胞和caf 的工具细胞(肝星状细胞,LX2)共培养后LX2 细胞中miRNA表达谱的改变,筛选并验证出具特征性改变的miRNA,并探究这种变化对肝癌细胞功能的影响及相关机制方法 利用caf 的工具细胞(LX2 细胞株)和3 种不同肝癌细胞株通过体外共培养体系建立癌相关成纤维细胞模型,并利用miRNA 芯片检测分析其miRNA 谱.结合不同筛选方法,筛选出癌相关成纤维细胞异常表达的miRNA 作为候选miRNA,并在细胞模型中利用qPCR 对候选miRNA 的表达水平进行验证.同时收集成对初发肝癌患者的癌和癌旁组织,通过磁珠分选分离出成纤维细胞,进一步在临床标本中验证miRNA 表达水平.收集共培养后的肝癌细胞与对照细胞验证其miR-148a 的变化情况.通过转染慢病毒载体建立稳定高表达miR-148a 的肝癌细胞株.通过CCK-8 增殖试验探索miR-148a 对肝癌细胞增殖的影响；利用划痕和transwell 侵袭实验探索miR-148a 对肝癌细胞迁移和侵袭能力的影响.通过TCGA 数据库验证miR-148a 的临床意义.从5 个公共数据库探寻miR-148a 的靶基因,并通过qPCR 和双荧光素酶报告基因检测验证靶基因.分离纯化外泌体,通过形态和western 验证外泌体表面标记物.建立高表达miR-148a 的LX2 细胞株,探究LX2 自身变化是否影响其外泌体miR-148a.利用荧光共聚焦等方法探究HCC 细胞是否摄取LX2 细胞外泌体.通过携载miR-148a 外泌体作用HCC 细胞,验证外泌体是否影响HCC 细胞功能结果 hsa-miR-148a-3p(miR-148a)是肝癌caf 的特征性低表达miRNA,参与了肝癌微环境的建立.同时发现,共培养后肝癌细胞中miR-148a 表达显著下调.通过建立稳定高表达miR-148a 的肝癌细胞株,证实高表达miR-148a 的肝癌细胞株其增殖、迁移、侵袭能力均显著减弱.高表达miR-148a 的肝癌病人较低表达者具有更好的预后.通过双荧光素酶报告基因法验证,Wnt10b 是miR-148a 的下游靶基因.我们进一步发现,共培养后LX2 细胞分泌的外泌体中miR-148a 的含量显著减少,与肝癌细胞中表达水平同步变化.通过建立高表达miR-148a 的LX2 细胞株后进一步证实,LX2细胞分泌的外泌体中miR-148a 含量与LX2 细胞中表达情况一致.肝癌细胞通过摄取携载高表达miR-148a 的LX2 来源的外泌体,其增殖、迁移和侵袭能力均显著下降.结论 miR-148a 是肝癌相关成纤维细胞的特征性低表达miRNA,可能参与肿瘤微环境的建立并调控肿瘤发生发展.miR-148a 可下调wnt10B 表达进而抑制肝癌细胞增殖和侵袭；miR-148a 可能成为HCC 患者预后的标志物.LX2 可以通过外泌体传递miRNA,进而影响HCC 细胞功能.通过以上实验初步证实,肝癌发生后肝星状细胞逐渐转变为肝癌caf,其自身miR-148a 表达含量下降,其分泌的外泌体中miR-148a 的含量也随之降低,即肝癌微环境中,外泌体携载的miR-148a(抑癌miRNA)减少；对于肝癌细胞来说,其摄取外源性的抑癌因素减少(细胞内miR-148a 含量减少),从而进一步促进肝癌的发生发展.
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