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目的 :目前用病毒分离、血清学检测以及RT-PCR方法等检测H5N1亚型禽流感病毒,由于耗时较长、操作复杂、无法区分感染与免抗体等缺陷已无法满足快速诊断的需要,因此建立灵敏、特异、快速、高通量的荧光定量PCR方法已势在必行,对AIV的早期快速诊断和采取有效防控措施有重要的意义。方法 :根据Gen Bank中公布的禽流感病毒M基因的高度保守序列,设计了1对通用型引物和1条Taq Man MGB荧光探针;根据H5禽流感病毒HA基因的型特异性序列,设计了1对H5亚型特异性引物和1条Taq Man MGB荧光探针;以流感病毒Uni-12引物作为共用反转录引物。用构建好的阳性重组质粒作为标准品绘制标准曲线,通过对反应条件的优化,用敏感性试验、特异性试验、稳定性及重复性试验、应用试验对本方法进行验证。结果与结论 :本研究对引物与探针浓度进行优化,以提高反应的扩增效率与敏感度。以终浓度1.0×105拷贝/μL的重组质粒作为检测模板,应用荧光PCR仪采用矩阵法筛选不同浓度的引物和探针组合,筛选针对AIV-T/AIV-H5基因的复合FQ-PCR最佳引物浓度、探针浓度和最佳反应条件。该方法在1.0×101~1.0×107copies/μL检测范围之间具有良好的线性关系,最小检出量达到10 copies/μL;具有较好的重复性、稳定性;与灭活的AIV H7亚型及H9亚型抗原、新城疫病毒、传染性喉气管炎病毒、鸡传染性法氏囊病毒核酸无交叉反应,具有较好的特异性。由国内具有AIV病毒分离培养研究资质的实验室用本研究建立的方法对其保存的36份疑似禽流感病毒样本进行检测,与商品化禽流感病毒通用型、H5亚型2种荧光PCR检测试剂盒同时检测结果相比,本方法显示出操作简便、耗时短、高通量、敏感稳定的特点,从而说明该方法可用于临床样品中微量禽流感病毒病毒的定型检测。