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研究背景和目的肺癌是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一,空气污染是其发生的重要危险因素。黄曲霉毒素B1（AFB1）是公认的Ⅰ类强致癌物,除污染食品外,还可广泛存在空气中,与呼吸系统肿瘤的发生风险高度相关。课题组前期研究表明,体外AFB1长期低剂量暴露可诱导人支气管上皮细胞（BEAS-2B）发生恶性转化,并在裸鼠体内成瘤,但分子机制尚待阐明。鉴于非编码RNA在肿瘤发生发展中的调控机制已成为当前医学遗传学的研究热点,本项目利用经AFB1诱导恶性转化的BEAS-2B细胞（T-BEAS）构建circRNA、mi RNA和m RNA差异表达谱,试图探索circRNAmi RNA-mRNA轴在细胞恶性转化中的调控作用,为阐明AFB1致肺癌的分子机制、寻找早期生物学标志及防治靶点提供线索。研究方法 1、分析比较T-BEAS细胞及同期对照细胞中的circRNA、mi RNA及m RNA表达谱,筛选出与细胞恶性转化相关的差异基因;利用q RT-PCR检测差异基因在恶性转化细胞及肺癌细胞株中的表达水平,结合数据资料,分析其表达水平与肺癌患者预后关系。2、通过对RNase R酶的耐受性检测及sanger测序,验证hsacirc0041714闭合性结构及成环序列;利用荧光原位杂交实验观察hsacirc0041714亚细胞定位情况。3、应用瞬时转染干扰T-BEAS细胞中hsacirc0041714、hsamiR3663-3p及ID3的表达;运用平板克隆形成实验、EDU染色法检测细胞的体外增殖能力;划痕实验评估细胞迁移能力。4、通过RIP实验验证hsacirc0041714与hsamiR3663-3p的靶向关系;采用原位杂交观察两者共定位关系。5、通过双荧光素酶报告基因验证hsamiR3663-3p与ID3的直接结合关系。6、Western blot检测hsacirc0041714或hsamiR3663-3p对ID3分子表达水平影响。研究结果:芯片分析得到4313个差异表达的circRNA,60个差异表达的mi RNA,1014个差异表达的m RNA;在表达上调的circRNA中,hsacirc0041714表达水平较高,分析其靶向mi RNA为hsamiR3663-3p且表达下调;进一步分析提示ID3为功能靶基因,ID3在恶性转化细胞中高表达,数据库分析结果显示,ID3与肺癌预后相关,ID3高表达者预后较差;hsacirc0041714具有环状闭合结构且与hsamiR3663-3p共定位于胞质中;RIP结果显示细胞转染hsamiR3663-3p模拟物后,hsacirc0041714在AGO2拉下的复合物中明显富集,提示hsamiR3663-3p可以AGO2方式直接靶向hsacirc0041714;干扰hsacirc0041714表达可抑制TBEAS细胞的增殖、克隆形成及划痕愈合能力;过表达hsamiR3663-3p可抑制ID3蛋白的表达,同时抑制T-BEAS细胞的增殖、克隆形成及划痕愈合能力;在T-BEAS中敲降ID3后,细胞的增殖、克隆形成及划痕愈合能力减弱。研究结论 1、hsacirc0041714在经AFB1持续处理的肺上皮恶性转化细胞中高表达,其与肺部肿瘤发生发展相关。2、hsacirc0041714通过吸附抑制hsamiR3663-3p功能,上调ID3蛋白表达水平从而促进恶性转化细胞的增殖及侵袭转移。