论文部分内容阅读
随着植物基因工程的发展,用转基因植物表达外源蛋白相对于传统疫苗而言是一种更安全、更经济的表达系统.玉米是养鸡业的主体饲料,如果将鸡球虫保护性抗原基因整合到玉米基因组中并表达,再用转基因玉米饲喂鸡,便可预防鸡球虫病.鸡球虫病是养鸡业多发病,死亡率高,对该病通常以药物防控为主,但由此带来的诸如药物残留以及抗药性问题是显而易见的,因此用疫苗来预防鸡球虫病较成为较理想的方法.Etmic2是柔嫩艾美耳球虫微线分泌的蛋白,研究表明EtMIC2基因表达产物能抵御柔嫩艾美耳球虫入侵鸡肠上皮细胞,可作为疫苗的候选分子.本研究根据NCBI上E.tenella豪顿株的MIC2基因cDNA序列(FJ807654.1),设计了特异性引物,经RT-PCR扩增,并将回收产物连接至pEASY-T1 Simple Vector,转化JM109感受态细胞,经PCR和双酶切鉴定,并对鉴定为阳性的克隆质粒进行测序,将测序结果进行序列的比对分析.结果表明：本试验成功扩增出了长为1029bp的MIC2基因的全长cDNA序列,其编码343个氨基酸.与豪顿株相比同源性达99％以上,这说明MIC2基因在不同地理株之间有很高的保守性.再根据MIC2基因序列和植物双元表达载体pCAMBIA-1301设计上下游引物分别含有Bgl Ⅱ和BstE Ⅱ酶切位点、His标签.以克隆载体pEASY-T1-MIC2为模板,用上述引物进行PCR扩增,获得了MIC2全长基因.经纯化、回收后的片段和pCAMBIA-1301质粒用Bgl Ⅱ/BstE Ⅱ双酶切,连接MIC2基因,His标签序列插入植物双元表达载体pCAMBIA1301构建重组载体pCAMBIA1301-MIC2,并利用热应激法转化农杆菌EHA105.结果表明：重组载体pCAMBIA1301-MIC2经双酶切、PCR扩增和序列测定,表明MIC2基因、His标签序列已正确插入pCAMBIA1301中.在含50mg/L卡那霉素和50mg/L利福平的YEB培养基上筛选及对转化农杆菌质粒进行MIC2基因的PCR和双酶切检测,证明植物双元表达载体pCAMBIA1301-MIC2构建正确.