【摘 要】
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本研究克隆了海省藏羊源EgAgB8/2基因,构建原核表达载体,鉴定诱导表达后的蛋白.在青海省收集藏羊感染的棘球蚴包囊无菌收集原头节,提取原头蚴总RNA,反转录酶试剂盒M-MLV
【机 构】
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青海省畜牧兽医科学院,青海西宁 810016
【出 处】
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中国畜牧兽医学会兽医寄生虫学分会第十三次学术研讨会
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本研究克隆了海省藏羊源EgAgB8/2基因,构建原核表达载体,鉴定诱导表达后的蛋白.在青海省收集藏羊感染的棘球蚴包囊无菌收集原头节,提取原头蚴总RNA,反转录酶试剂盒M-MLV合成cDNA第一链.用引物扩增EgAgB8/2基因cDNA片段.EcoR Ⅰ和HindⅢ双酶切RT-PCR胶回收产物,与经相同双酶切的原核表达载体pET-32a(+)大片段连接,构建重组原核表达载体pET-EgAgB8/2,转化E.coliDH5α感受态细胞.经Amp抗性筛选阳性克隆,提取重组质粒,单、双酶切和PCR检测正确送试剂公司测序.鉴定正确的pET-EgAgB8/2重组质粒,转化至E.coliBL21中,鉴定阳性菌摇菌扩繁,进行诱导表达,离心收集菌体,超声裂解,离心,SDS-PAGE电泳检测上清和沉淀中的目的蛋白.诱导表达后离心收集菌体,加入溶菌酶,超声波破碎菌体,离心分离上清,纯化.取纯化蛋白样品进行SDS-PAGE电泳分离、转染PVDF膜,氨基黑染色,甲醇褪去背景色,观察条带.将转印后的PVDF膜浸在甲醇中活化,去除甲醇,脱脂奶粉室温.以his-单抗为一抗,以羊抗鼠IgG-HRP为二抗,用ECL法进行检测.结果表明：克隆的EgAgB8/2基因包含了273 bp的完整ORF,序列分析表明与其它已报道的EgAgB8/2 cDNA序列的同源性在98％～100％之间,原核表达载体pET-EgAgB8/2构建正确.诱导表达后,通过SDS-PAGE检测,上清中有大量目的蛋白表达.纯化的蛋白经Westem blot鉴定为目的蛋白.成功克隆了青海省藏羊源EgAgB8/2基因,构建了原核表达载体,诱导表达后的蛋白为目的蛋白.
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