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细胞外囊泡(extracellular vesicles,EVs)是绝大多数细胞都能分泌的具有膜结构的囊泡,主要包括微泡(microvesicles,MVs)和外泌体(exosomes),广泛分布于人体各种细胞外液,是细胞间通讯的重要媒介。EVs选择性地继承母细胞中的脂质,蛋白质和核酸(包括DNA和RNA),其中microRNA(miRNA)是EVs中研究最多的分子,但目前还没有关于EVs中miRNA表达谱的系统数据资源。EVs在液体活检方面前景广阔,目前间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)来源的EVs是最广泛的研究对象之一。MSCs是一种具有多向分化,造血支持等功能的干细胞,广泛分布于骨髓,脂肪和脐带(umbilical cord,UC)等组织,其中脐带来源的MSCs(UCMSCs)被证实具有更强的增殖能力和细胞干性。MSCs的衰老会导致骨质疏松,组织修复能力降低以及白血病骨髓瘤疗效差等问题,因此表征MSCs衰老的标志物研究和逆转MSCs衰老效应的机制研究,对人类健康意义重大。这里,我们系统地研究EVs来源miRNA表达谱,利用MSC-MVs表征MSCs衰老状况和UCMSC-MVs逆转MSCs衰老,取得了以下三个方面的成果。1.EVmiRNA:EVs的miRNA表达谱数据库我们收集了459个EVs小RNA测序数据,包括237个微泡样本和222个外泌体样本,这些样本来自于17种组织和10种癌症。建立了统一的流程对这些小RNA测序数据进行分析,获得了所有EVs的miRNA表达谱,并使用实验室自主开发的特异表达基因检测工具SEGTool,鉴定出317个EVs特异miRNA,其中部分miRNA已经被证明为生物标志物。通过比较MVs和外泌体miRNA表达谱,发现miR-21-5p在多数组织来源的EVs中均高表达;miR-99a-5p,miR-3168和miR-192-5p/miR-10a-5p分别在血液,乳腺和大肠组织的EVs中保守分泌且高表达。另外,对EVs中表达的miRNA进行了详细的注释,包括miRNA基本信息,miRNA功能,miRNA在EVs和TCGA中表达量,miRNA对靶基因和pathway的调控等。进一步,建立了EVmiRNA数据库(http://bioinfo.life.hust.edu.cn/EVmiRNA/#!/),EVmiRNA展示了所搜集EVs的miRNA表达谱,特异表达mi RNA,miRNA注释,原始数据链接,各样本所属文献,分离方法和miRNA isoform比对结果,所有资源均免费浏览下载。EVmiRNA是首个系统整理和分析EVs中miRNA表达谱的数据库,为EVs的miRNA生物标志物和功能研究提供重要资源。2.MSC-MVs作为表征MSCs衰老的生物标志物研究通过观察早代和晚代MSCs及其分泌的MSC-MVs的表型,并分别对这些样本进行转录组和小RNA测序。发现伴随着MSCs衰老,MSC-MVs分泌量增加,促成骨分化能力降低和促成脂分化能力增强,MSCs和MSC-MVs中miRNA丰度降低,mRNA丰度无明显变化。差异表达分析显示,随着衰老,MSCs和MSC-MVs中差异表达基因显著富集于衰老相关通路,如老年痴呆症,帕金森疾病等通路。通过结合MSCs衰老TF-miRNA共调控网络和RNA表达谱,发现miR-146a-5p随着MSCs衰老在MSC-MVs和MSCs中表达量稳定上升,且在多个MSCs衰老miRNA数据集中得到证实。另外,实验验证证明miR-146a-5p的靶基因随着衰老,在MSCs和MSC-MVs表达量降低。MSC-MVs可以从其分泌能力,促分化能力和miRNA表达量多个层面表征母细胞MSCs的衰老状态。3.UCMSC-MVs作为逆转BMSCs衰老效应工具研究通过比较胎儿骨髓(fetal bone marrow,FB)来源MSCs(FBMSCs)和成人骨髓(adult bone marrow,AB)来源MSCs(ABMSCs)的mRNA和miRNA表达谱,发现FBMSCs的mRNA和miRNA表达丰度比ABMSCs高,FBMSCs中细胞周期和DNA修复通路活性更强,CDK家族基因表达更活跃。UCMSC-MVs培养ABMSCs,使得ABMSCs的成骨分化能力增强,成脂分化能力减弱,细胞周期和DNA复制修复通路被激活且向FBMSCs转化,75%的差异表达基因向FBMSCs转化,76%衰老相关基因向FBMSCs转化。结合ABMSCs细胞周期和DNA修复相关蛋白互作网络和RNA表达谱,筛选到UCMSC-MVs中关键分子PCNA,该分子通过激活ABMSCs中细胞周期和DNA复制修复通路,逆转ABMSCs衰老。进一步,对ABMSCs中PCNA在蛋白和m RNA的层面分别进行表达抑制,发现ABMSCs出现早衰的表型,且细胞周期和DNA修复相关基因表达降低;再加入UCMSC-MVs后,ABMSCs衰老向年轻表型转化,且细胞周期,DNA复制修复,蛋白合成和能量代谢相关通路被激活。UCMSC-MVs作为效应工具逆转ABMSCs衰老,其中PCNA是激活ABMSCs细胞周期和DNA修复通路逆转衰老的关键分子。本课题建立EVs来源miRNA表达谱数据库,为EVs中的miRNA研究提供重要资源。本研究证明MSC-MVs是MSCs的潜在生物标志物,MSC-MVs可从其分泌能力以及miRNA表达量等多个层面表征母细胞衰老;并利用UCMSC-MVs作为效应工具逆转ABMSCs衰老,探索PCNA激活细胞周期和DNA修复逆转衰老的关键机制,为EVs作为生物标志物和效应工具研究提供理论基础和思路。