肠出血性大肠杆菌O157:H7感染是重要的新发食物源性传染病,主要引起耍幼儿腹泻、出血性结肠炎和溶血性尿路综合症等。志贺毒素是肠出血性大肠杆菌O157:H7最重要的毒力因子之一,同时也是最重要的抗原之一。本研究利用基因工程的方法,将编码Stx1A和Stx2A亚基的毒性活性中心和跨膜区的基因序列进行定点突变。主要突变位点。包括Stx1毒性活性区第167位的谷氨酸突变成天冬氨酸(E167D),第170位的精氨酸突变成亮氨酸(R170L)；跨膜区第231位的丙氨酸突变成天冬氨酸(A231D),第234位的甘氨酸突变成谷氨酸(G234E)。Stx2毒性活性区第166位的谷氨酸突变成天冬氨酸(E166D)；跨膜区第219位的丙氨酸突变成天冬氨酸(A219D),第232位的甘氨酸突变成谷氨酸(G232E)。将A亚基的毒性活性区和跨膜区同时突变的Stx1和Stx2突变体基因克隆到pUC18质粒中,构建重组质粒pSTX1.3-STX2.3,将重组质粒转入大肠杆菌DH5α中进行表达。并利用vero细胞,对这些不同的Stx突变体的细胞毒性进行研究。 结果：跨膜区定点突变后Stx2的毒性有一定下降,而对Stx1的毒性无明显影响。毒性活性区定点突变后,Stx1和Stx2的毒性都明显降低.毒性活性区和跨膜区同时突变后,Stx1和Stx2的毒性都已降低,Stx1毒性降低了约1000倍,而Stx2的毒性已基本消除.重组质粒pSTX1.3-STX2.3中带有毒性活性区和跨膜区同时突变的Stx1和Stx2突变体基因,将该重组质粒转入O157:H7基因缺失突变菌株F25.导入重组质粒后的重组菌株,一方面主要毒力基因(stx1和stx2)和毒力因子调控基因(ler)都已缺失,细菌的致病性已基本消除,另一方面又导入了毒性已消除或降低的Stx1和Stx2突变体基因,该菌株又具有Stx的免疫原性,因此从理论上分析,该菌株的免疫原性将比F25更好。本研究为构建EHEC O157:H7基因工程弱毒疫苗菌株奠定了基础。