【摘 要】
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以肠膜明串珠菌基因组DNA为模板,通过PCR 扩增得到1581bp的蔗糖磷酸化酶(SPase)DNA 片段.将该基因克隆到表达载体pET22b(+)上,构建获得重组质粒pET-SPase.将pET?SPase 转化到Escherichiacoli Rosetta(DE3)感受态中,IPTG 诱导表达后进行SDS-PAGE分析,目的蛋白条带约为55 kD,与预期大小一致,结果表明SPase 基因在大
【机 构】
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南京工业大学生物与制药工程科学学院,材料与化学工程国家重点实验室,江苏南京,210009
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以肠膜明串珠菌基因组DNA为模板,通过PCR 扩增得到1581bp的蔗糖磷酸化酶(SPase)DNA 片段.将该基因克隆到表达载体pET22b(+)上,构建获得重组质粒pET-SPase.将pET?SPase 转化到Escherichiacoli Rosetta(DE3)感受态中,IPTG 诱导表达后进行SDS-PAGE分析,目的蛋白条带约为55 kD,与预期大小一致,结果表明SPase 基因在大肠杆菌中进行了表达.摇瓶培养试验表明IPTG、乳糖及乳清粉的诱导效果相似,都可以有效的诱导SPase的表达,而乳清粉不仅可以诱导蛋白表达同时作为碳源促进菌体生长.当加入20g/L 乳清粉并添加5g/L 甘油时,蔗糖磷酸化酶的酶活最大,为37U/mL.在5L 发酵罐的放大培养中,通过流加乳清粉、甘油和微量元素的混合物补料,生物量达到OD600=32,SPase 酶活为5600U/L.
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以酪蛋白为底物,考察了时间、温度、底物浓度及缓冲液pH值对木瓜蛋白酶酶活的影响,并探讨了Hg2+对木瓜蛋白酶的米氏常数、活化能的影响.研究表明: 木瓜蛋白酶的最优酶解条件为温度45℃,底物浓度2.0 mg/mL,pH 7.0,酶解30min.与对照组相比,10-6 mol/L的Hg2+处理的木瓜蛋白酶与底物的亲和力变大,Ea 降低.Km值分别为1.8462和1.75mg/mL;Ea分别为14.46
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本文利用PCR方法从表皮葡萄球菌基因组DNA中扩增到两条D-乳酸脱氢酶基因(SE2074，SE2121),并连接到载体pET-15b上,构建表达质粒pET-15b-SE2074和pET-15b-SE2121.将重组质粒分别转入大肠杆菌Rosseta(DE3)中,重组菌株经IPTG诱导表达.SDS-PAGE电泳分析表明两条D-乳酸脱氢酶基因在大肠杆菌中实现了表达,表达产物的分子量均约为37 kDa.
途径工程(Pathway engineering)经常涉及多酶催化,需将多个酶基因克隆至同一载体进行共表达.目前大多数载体构建仍延用传统的"酶切-连接"策略,操作步骤多,需要多种酶和载体,克隆多基因时耗时长,克隆大片段时又难于连接.PCA 策略可提高载体构建效率,该方法依赖DNA 聚合酶而不是连接酶.设计的20 bp 引物跨越目的基因两端及其相邻的载体骨架,通过重叠PCR 可将目的基因和载体骨架连
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采用新月弯孢霉(Curvularia lunata AS 3.4381)全细胞11β羟化17α醋酸羟基孕酮,生物催化后11β羟化产物主要有两种:直接底物11β羟化产物以及17位醋酸酯水解后的β羟化产物,催化反应副产物较少.在此基础上,优化了霉菌催化转化的培养基组成、操作条件等工艺参数.采用预处理方式将底物制备成亚微米级悬浮液,可使底物转化所需时间缩短一半,在0.6g/L 投料浓度下11β羟化产物转