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【研究背景】油酸合成受一个主效基因脂肪酸去饱和酶2 (FAD2)和多个微效基因影响,但目前的研究多集中于FAD2,对相关微效基因的研究仍然欠缺。miRNA测序灵敏度高,精度高,既能鉴定已知的miRNA,又能预测新的miRNA及其对应靶基因,在拟南芥、水稻、小麦等众多作物的不同组织、器官中均有应用。油菜中,已发现一些miRNA及其靶基因参与油菜生长发育过程,其中与脂肪酸代谢相关的mi R394、mi R838、mi R159等以及一些新预测的miRNA,同其靶基因相互作用,共同调控油菜脂肪酸代谢过程。可通过miRNA的靶基因克隆以深入脂肪酸合成的相关研究,以期为高油酸油菜分子育种提供参考资料。【材料与方法】供试材料为高油酸油菜近等基因系,由湖南农业大学油料所提供。实验菌株为大肠杆菌感受态DH5α,购自于北京擎科生物公司。实验载体为pCambia1300-35S-N1,购于上海康颜生物公司。试验方法包括:RNA的提取和检测、c DNA第一链的合成、PCR扩增、靶基因扩增、PCR产物回收、过表达载体构建、干扰载体的构建。【结果与分析】XbaI及BamHI双酶切pCambia1300-RNAi载体以及各个基因的RNAi片段的PCR产物,胶回收,进行连接,获得重组质粒。测序正确后,PstI和SalI双酶切重组质粒及各个基因的RNAi片段的PCR产物,再次进行连接,转化,获得最终的RNAi载体。以高油酸油菜20-35天自交种为材料,c DNA为模板,高保真扩增了这6个靶基因,其中bna-miR156b>c>g的4个靶基因长度分别为1122bp(949),1119bp(124)1119bp(829),1125bp(135),bna-miR396的2个靶基因114和148均为1350bp,目的条带符合预期。以合成的c DNA为模板,分别对6个靶基因特异片段进行PCR高保真扩增,均得到了目的片段长度大小的DNA片段。最终得到AT基因的两个拷贝114与148过表达重组质粒。OPR基因的124与829拷贝见,949与135拷贝。该工作对甘蓝型油菜的基因组进化规律进行揭示,从根本上促进了甘蓝型油菜的育种研究。本试验直接通过拟南芥与油菜基因共线性分析,在甘蓝型数据库进行检索,使试验设计更具有目的性与准确性,从而分别获得AT基因位于A基因组和C基因组的两个拷贝114与148,和OPR基因在A基因组和C基因组的各两个拷贝。且对6个基因分别构建了过表达载体与RNAi干扰载体,为下一步试验提供基础。【结论】基因克隆分别扩增到bna-miR396靶基因AT的两个拷贝114与148,两个拷贝全长均为1350bp。bna-miR156b>c>g靶基因OPR的4个拷贝,长度分别为1122bp(949),1119bp(124)1119bp(829),1125bp(135),的114和148均为1350bp,目的条带符合预期。成功构建了这6个基因的过表达载体pCambia1300-35S-X和RNAi干扰载体pCambia1300-RNAi-X,并绘制了相关图谱。