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目的探讨靶向白血病干细胞新单抗3A4单链抗体融合增强型绿色荧光蛋白(3A4scFv-EGFP)真核表达载体的构建及其在CHO细胞中的稳定表达和分泌研究。方法采用PCR方法从pEGFP-N1载体中扩增出含XbaI/ApaI酶切位点的EGFP片段并转入pcDNA3.1(+)载体中,经测序验证成功构建pcDNA3.1/EGFP表达载体。然后将本实验室已构建成功并保存的pcDNA3.1/scFv-Fc质粒与提取的pcDNA3.1/EGFP质粒同时进行EcoRI/ApaI双酶切,将EGFP片段替换Fc段连接至载体片段上构建pcDNA3.1/scFv-EGFP3A4真核分泌型表达载体。经测序验证成功后抽提纯化质粒,采用LipofectamineTM2000脂质体法转染中国仓鼠卵巢(CHO)细胞并进行表达,600μg/mlG418筛选2周后进行亚克隆并建株,从中挑出表达绿色荧光的稳定细胞株进行扩大培养。采用SDS-PAGE和Western blot方法检测转染细胞培养上清中3A4scFv-EGFP融合蛋白的表达情况及分子量。用免疫荧光显微镜观察细胞培养上清中3A4scFv-EGFP与KG1a细胞的结合情况,同时用抗鼠Fab段特异的四甲基异硫氰酸罗丹明(tetramethyl rhodamine isothiocynate,TRITC)标记的抗体与GFP共定位以观察3A4scFv-EGFP在转染的CHO细胞中表达情况。最后采用流式细胞仪检测3A4scFv-EGFP融合蛋白在培养上清中分泌的相对浓度,并检测其对3A4亲本抗体的阻滞作用。结果成功构建pcDNA3.1/EGFP及pcDNA3.1/scFv-EGFP3A4表达载体,转染CHO细胞后约20小时即可观察到绿色荧光。经G418筛选2周后进行亚克隆建株,挑选出一株稳定表达强绿色荧光蛋白的细胞株3A4scFv-EGFP/CHO。SDS-PAGE和Western blot法证实3A4scFv-EGFP融合蛋白在细胞培养上清中表达,分子量大小约57.4kDa,与理论预测一致。荧光显微镜观察到稳定分泌至培养上清中的3A4scFv-EGFP融合蛋白能与KG1a细胞表面抗原结合,同时在3A4scFv-EGFP/CHO细胞中TRITC激发的红色荧光与GFP的绿色荧光部位重叠,均以颗粒形式聚集分布在靠近细胞的两极,而转染pcDNA3.1/EGFP质粒的对照CHO细胞中未见红色荧光且绿色荧光均匀分布在细胞质中。流式细胞术检测3A4scFv-EGFP融合蛋白在培养上清中分泌的相对浓度为135μg/L,并且该蛋白具有阻滞3A4亲本抗体与KG1a细胞抗原结合的特性。结论成功构建了靶向白血病干细胞新抗体3A4scFv-EGFP真核表达载体,并证实CHO细胞能稳定表达和分泌可溶性的scFv-EGFP融合蛋白,且所表达的3A4scFv-EGFP融合蛋白保留抗体识别抗原活性。