【摘 要】
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锌指蛋白(Zinc Finger protein,ZFP)在基因转录和翻译过程中有着非常重要的作用,可以同时调控多基因表达,并且参与蛋白质之间相互作用.因此,对生物体的生长、发育及其代
【机 构】
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大连理工大学生命科学与技术学院,大连116023大连理工大学生命科学与技术学院,大连116023;上海交通大学生命科学技术学院,上海201100上海交通大学生命科学技术学院,上海201100
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锌指蛋白(Zinc Finger protein,ZFP)在基因转录和翻译过程中有着非常重要的作用,可以同时调控多基因表达,并且参与蛋白质之间相互作用.因此,对生物体的生长、发育及其代谢具有重要的调控作用.对转录因子进行人工设计和改造得到的人工转录因子(Artificail Transcription Factor,ATF),包括对人工锌指区序列及其排列顺序进行设计和改造得到的人工锌指蛋白,已被广泛应用于植物和哺乳动物,但是,利用人工锌指蛋白技术改造工业微生物菌种方面研究相对较少.本课题组将含有人工锌指蛋白编码基因的人工转录因子表达载体文库通过农杆菌介导技术转入丝状真菌里氏木霉Trichoderma reesei RUT-C30中,以纤维素为唯一碳源进行发酵筛选,获得了多株高产纤维素酶的突变体.其中突变体M2在摇瓶发酵中,滤纸酶活(Filter Paper Activity,FPA)较亲本提高约40％.5L发酵罐批次发酵验证发现,M2突变体产酶最高点时间提前,发酵前3天,较亲本滤纸酶活可提高200％.通过突变体基因组PCR扩增,获得M2中整合的人工转录因子锌指序列.经过步移PCR,发现该锌指序列插入到里氏木霉一未知蛋白的基因间隔区,这说明酶活的提高不是因为破坏基因功能导致的.对人工锌指蛋白可能结合的靶点基因进行预测,发现在突变体中一个功能未知的可能靶点基因在产酶过程中明显表达上调.此外,将对该突变体和野生菌株进行比较转录组学分析,将揭示人工转录因子对T.reesei RUT-C30转录调控的新机制,并通过功能分析发现关键的代谢调控基因,用于进一步提高T.reesei RUT-C30的纤维素酶生产效率.
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