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目的：对前期通过比较基因组学和生物信息学等方法筛选出的结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,M.tb) Rv1516C基因的特异性及其抗原性进行一步鉴定和分析,探讨其作为新型结核病特异性标志物的可行性.
方法：设计针对Rv1516C基因的特异性引物,以结核分枝杆菌H37Rv菌株及BCG(卡介苗)、鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌、蟾分枝杆菌、土地分枝杆菌、胃分枝杆菌、不产色分枝杆菌、玛尔摩分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、海分枝杆菌、猿分枝杆菌、亚洲分枝杆菌、瘰疬分支杆菌、戈登分枝杆菌、苏加分枝杆菌、龟分枝杆菌、脓肿分枝杆菌、偶发分枝杆菌、耻垢分枝杆菌、草分枝杆菌、微黄分枝杆菌的基因组DNA为模板,采用PCR方法扩增Rv1512基因的特异性片段.每个样品除扩增该基因特异性目标片段外,同时还扩增通用序列ITS(内转录间隔区)的长度为485bp基因片段,作为内对照,以检测全部样品组的基因组DNA模板质量是否良好,确保特异性条带未扩增出不是因为模板的质量问题引起的.采用PCR方法扩增M.tbRv1516C基因,克隆入pET30a(+)质粒,构建pET30a(+):Rv 1516C重组质粒,阳性克隆测序验证正确后转化入表达宿主大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导RV1516C蛋白表达,经Ni+-NTA层析柱纯化获得重组蛋白.将纯化的RV1516C重组蛋白免疫新西兰大白兔,制备抗RV1516C抗血清,抗血清的效价测定采用酶联免疫吸附试验法(EHSA),将该兔抗血清进一步纯化获得其多克隆抗体,采用免疫印迹方法(Westem Blot)鉴定该多克隆抗体与重组蛋白RV1516C的免疫反应性,并检测该多克隆抗体的特异性.应用免疫印迹方法(Western Blot)同时检测结核病病人阳性血清和PPD阴性正常人血清中是否存在RV1516C抗原基因对应的抗体.
结果：仅在H37Rv组扩增出结核分枝杆菌Rv1516基因的特异性片段,而在其它21组中均没有扩增出该基因特异性片段,而通用序列ITS(内转录间隔区)的长度为485bp基因片段在全部22组中均扩增出相应的片段,进一步证实Rv1516基因可能为结核分枝杆菌H37Rv所特有.经酶切鉴定和测序分析证实Rv1516C原核表达质粒构建正确,SDS-PAGE和Western blot结果显示在47kD处呈现单一蛋白条带.用重组蛋白RV1516C免疫接种新西兰大白兔后可诱导出高滴度的特异性抗体,并制备了其多克隆抗体.纯化的重组蛋白RV1516C被证实有较强的免疫原性;重组蛋白RV1516C可与结核病人阳性血清在大约47KDa处产生特异性免疫反应条带.提示该蛋白具有抗原性,在结核病人体内很可能存在相对应的抗体.
结论：Rv1516基因可能为结核分枝杆菌H37Rv所特有,具有较好的特异性.用重组蛋白RV1516C免疫接种新西兰大白兔后可诱导出高滴度的特异性抗体,证实RV1516C重组蛋白具有较好的免疫原性;重组蛋白RV1516C可与结核病人阳性血清在大约47KDa处产生特异性免疫反应条带,证实其具有较好的免疫反应性.这为进一步研究其作为结核病的潜在分子标志物的可行性奠定了基础.