【摘 要】
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西尼罗病毒(West Nile virus, WNV)膜蛋白E(EnvelopeGlycoprotein)结构域Ⅲ(domainⅢ)位于WNV病毒膜蛋白的最表面,是诱导机体产生抗体的主要保护性抗原,同时domainⅢ也是WNV感染细胞时与细胞表面结合的主要位点。本研究根据GenBank中发表的WNVE domainⅢ基因序列设计了一对引物并分别引入NotⅠ和NcoⅠ酶切位点,用PCR方法扩增dom
【机 构】
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军事医学科学院野战输血研究所 100850 南方医科大学公共卫生与热带医学学院 510515
【出 处】
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第三次全国免疫诊断暨疫苗学术研讨会
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西尼罗病毒(West Nile virus, WNV)膜蛋白E(EnvelopeGlycoprotein)结构域Ⅲ(domainⅢ)位于WNV病毒膜蛋白的最表面,是诱导机体产生抗体的主要保护性抗原,同时domainⅢ也是WNV感染细胞时与细胞表面结合的主要位点。本研究根据GenBank中发表的WNVE domainⅢ基因序列设计了一对引物并分别引入NotⅠ和NcoⅠ酶切位点,用PCR方法扩增domainⅢ基因片段。回收目的基因片段,并用NotⅠ和NcoⅠ限制性内切酶消化,经纯化后,将其定向克隆入果蝇表达载体pMT/B/V5中,构建重组表达载体pMT-DⅢ。测序验证正确后,用脂质体转染法与辅助质粒pCoBlast共转染果蝇S2细胞,通过Blasticidin(杀稻瘟素)进行加压筛选,获得了抗性细胞S2-DⅢ。提取S2-DⅢ.细胞的基因组DNA, PCR检测目的基因在果蝇S2细胞中的整合与表达。用终浓度500μmol/L的硫酸铜溶液诱导表达,收集无血清的细胞表达上清,样品浓缩后进行SDS-PAGE及Western Blotting检测。结果表明,本研究成功构建了重组表达载体pMT-DⅢ,转染细胞经12μg/mL的Blasticidin筛选及鉴定后获得了稳定表达WNV E domainⅢ蛋白的果蝇S2细胞株。
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