论文部分内容阅读
【目的】本研究拟调查氨基糖苷类抗生素钝化酶基因、16S rRNA甲基化酶基因及整合酶基因在广东省各地区兽医临床细菌中的流行情况,并尝试将生物传感器技术与传统基因芯片技术相结合构建生物传感器芯片对aac(3)-Ⅱc、aac(6’)-Ⅰb、aadA1、aadA2、aph(4)-Ⅰa、rmtB、intI1、intI2 8种耐药基因进行检测。【方法】采用微量肉汤二倍稀释法对515株畜禽大肠杆菌进行6种氨基糖甘类抗生素敏感性分析:通过PCR扩增、序列分析检测氨基糖苷类钝化酶基因、16S rRNA甲基化酶基因及整合酶基因,并用建立的PCR方法调查各基因在515株畜禽大肠杆菌中的流行分布情况:针对aac(3)-Ⅱc、oac(6’)-Ⅰb、aadA1、aadA2、aph(4)-Ⅰa、rmtB、intI1、intI2等8种基因设计捕获探针,均为寡核苷酸探针,构建耐药性检测生物传感器芯片。通过生物素化的引物PCR扩增制备8种标记探针,与芯片在一定温度下杂交。利用多重PCR法制备标记探针与芯片杂交。【结果】药物敏感性分析结果表明,515株大肠杆菌对6种抗生素的耐药率从高到低依次为链霉素53.98%、卡那霉素40.78%、庆大霉素33.01%、大观霉素31.65%、新霉素29.32%、阿米卡星8.93%,各药耐药率随着时间推移有逐渐增高的趋势:515株大肠杆菌中对6种氨基糖苷类都敏感的菌株占30.29%,1耐、2耐、3耐、4耐、5耐、6耐株分别为19.42%、13.40%、13.59%、10.49%、8.16%、4.66%,共有38种多重耐药谱型。耐药基因流行分布调查结果显示,515株大肠杆菌中未检测到aac(3)-Ⅰa、aph(2’)-Ⅰb基因,其余10种氨基糖苷类钝化酶基因检出率从高到低依次是aph(3’)-Ⅶ(97.28%)、aph(3’)-Ⅱ(94.17%)、aadA2(71.07%)、aadA1(58.84%)、aac(3)-Ⅱc(39.61%)、aac(3)-Ⅳ(37.28%)、aph(4)-Ia(31.84%)、aph(3’)-Ⅳ(16.70%)、aac(6’)-Ⅰb(15.34%)、aadB(2.52%):515株大肠杆菌中有27株检测到16S rRNA甲基化酶rmtB基因,检出率为5.24%:整合酶intI1、intI2基因的检出率分别为75.92%、3.69%:构建的生物传感器芯片杂交结果表明:60℃是芯片杂交的最佳温度;8种探针特异性好,无交叉反应,对检测的耐药基因具有有效性:芯片的灵敏度为3pg/μL DNA模板浓度:芯斤重复性好、稳定性高,能检测多种基因的混合样品:确定了3组多重PCR体系,通用退火温度为51℃,能对8种基因进行有效扩增,制备的标记探针能与芯片发生有效杂交。【结论】氨基糖苷类耐药酶基因谱型错综复杂,13种耐药基因共有127种组合方式,以aadA1+aadA2aph(3’)-Ⅱ+aph(3’)-Ⅶ四种基因的联合方式最为常见。515株大肠杆菌耐药表型和钝化酶基因谱型关系复杂,总体趋势上一致,但未能完全对应。构建的生物传感器芯片杂交信号明显,肉眼清晰可见,无需配备专门的仪器设备进行观察,适宜于兽医临床推广。