玉米(Zea mays L)是世界重要的粮食与饲料作物,在我国属第一大粮食作物。河南是我国主要粮食产区之一,玉米在河南省是小麦收获后种植的最主要粮食作物。根据笔者前期调查结果,层出镰刀菌Fusarium proliferatum(Matsush.)Nirenberg ex Gerlach&Nirenberg是引起河南玉米穗腐病的主要病原菌,该菌对玉米的为害不仅表现在降低玉米产量上,更重要的是其产生的真菌毒素对玉米作为粮食及饲料的安全性构成严重威胁。目前尚无关于层出镰刀菌基因敲除的系统报道,层出镰刀菌基因敲除体系建立对于研究其致病性及毒素产生相关基因有重要意义。参考相关真菌基因敲除方法,成功建立了层出镰刀菌基因敲除体系。本研究以玉米穗腐病籽粒分离到的层出镰刀菌菌株FP1为研究材料,主要研究了菌株FP1基因敲除过程中原生质体的制备条件、同源重组核酸片段的PCR条件及转化过程中培养基种类、渗透压等对转化的影响。研究发现菌株FP1在察氏培养基静置培养5~7天的菌丝体易于酶解。酶解过程的最佳条件是37℃、120rpm振荡处理2~3h。最佳的酶组合为3%driselase,1%溶壁酶及0.1%几丁质酶。酶解后易于得到转化所需的108个/mL量级原生质体。通过两轮PCR快速制备替换核酸序列,基因两端侧翼序列800~1 200碱基易于发生同源重组。40%的PEG-4000能够促进外源核酸的转化。诱导转化子生长过程中,低熔点琼脂糖制备"夹心层"培养基利于转化子的生长。