论文部分内容阅读
研究背景：放射性肺损伤是胸部肿瘤放疗的常见并发症,严重影响了患者的疗效和生存质量,临床上表现为早期放射性肺炎和晚期不可逆性放射性肺纤维化,目前相关学说尚不能完全阐明其发病机理.Th1/Th2免疫系统紊乱与肿瘤微环境及放射损伤相关.目的：通过构建荷瘤与无瘤小鼠放射性肺损伤模型,观察不同时间点各组肺组织中Th1/Th2转录因子T-bet、GATA-3基因蛋白水平的差异以及血清相关细胞因子表达情况,了解荷瘤小鼠放射性肺损伤Th1/Th2免疫状态,探讨肿瘤体质和正常体质下放射性肺损伤发生发展的不同规律,以明确肿瘤模式下Th1/Th2免疫对放射性肺损伤的影响,推测其可能的作用机理,为将维持免疫平衡作为防治放射性肺损伤的新方法提供理论基础.方法：选取18-25g的C57BL/6雌性小鼠,在右腋窝皮下种植Lewis肺癌细胞株,肿瘤长至直径为0.5～1.0em时和无肿瘤小鼠随机进入实验组.用6MV X射线、单次12Gy照射全肺,照射后不同时间点记录是否喘息并评定等级(无喘息,轻度喘息,呼吸急促,喘息致死)、肿瘤大小和体重并处死小鼠,留取相应时间点小鼠肺组织及血清.通过HE染色、Masson染色及羟脯氨酸含量检测来评估荷瘤小鼠及无瘤小鼠组放疗后肺组织炎症和纤维化程度.当荷瘤小鼠出现呼吸困难伴体重下降且解剖肺组织HE染色可见肺内癌转移结节时停止继续观测.通过RT-PCR、Western blot、BDTMCBA多细胞因子检测技术等技术分析荷瘤及无瘤小鼠放疗后肺组织中Th1/Th2转录因子T-bet、GATA-3的基因和蛋白表达水平以及血清中相关细胞因子IFN-γ、 IL-13表达情况.结果 放疗3周内病理鉴定无转移的荷瘤小鼠照射组喘息出现时间早(第3天开始)、可见轻度喘息,放疗4周后荷瘤小鼠相继出现呼吸急促,体重下降明显10％～15％,解剖肺组织HE染色可见肺内少量癌细胞浸润,终止观测时间点到3周.无瘤小鼠照射组3周内尚未出现喘息.观测时间点内,肺组织HE染色(200x)可见荷瘤小鼠照射组炎性充血不明显；主要以间质增厚,肺泡正常结果消失为主；无瘤小鼠照射组间质充血及炎性细胞聚集,第3天明显,且持续时间久.Masson染色(200x)结果显示两组放疗后早期均有胶原沉积,且随时间推移不断增多,荷瘤小鼠照射组胶原沉积程度明显大于无瘤小鼠照射组.荷瘤小鼠照射组羟脯胺酸含量明显高于无瘤小鼠照射组(P＜0.05).实时定量PCR结果显示,荷瘤小鼠照射组Th2转录因子GATA-3基因表达水平在放疗后各时间点表达均较无瘤小鼠照射组要高,且在1周后迅速上升；荷瘤小鼠照射组Th1转录因子T-bet基因表达在放疗后早期(第1天)达到高峰后迅速下降,而无瘤小鼠照射组早期高反应后,2周后仍见升高趋势.Western blot结果与实时定量PCR结果相似,两组Th2转录因子GATA-3蛋白表达随时间的推移逐渐增加,各时间点荷瘤小鼠照射组Th2转录因子GATA-3蛋白表达均较无瘤小鼠照射组高；荷瘤小鼠照射组Th1转录因子T-bet蛋白表达随放疗时间呈现下降趋势,3周时表达量最低,而无瘤小鼠照射组3周内T-bet随放疗时间仍呈现上升趋势.BDTMCBA多细胞因子检测结果显示荷瘤小鼠照射组血清中Th2细胞因子IL-13蛋白含量随放疗后时间缓慢升高,在3周时达到高峰.除第3天表达高外, 荷瘤小鼠照射组Th1细胞因子INF-γ蛋白表达水平均较无瘤小鼠放射组低.结论：肿瘤体质下,小鼠较无瘤小鼠放射性肺纤维化发生时间提前且更严重,荷瘤小鼠放射性肺损伤模型同样存在Th1/Th2免疫失衡,但较无瘤小鼠放射性肺损伤模型更偏向于Th2反应,更趋向于肺纤维化.这可能作为临床肿瘤患者出现放射性肺损伤肺纤维化不可逆现象的部分解释.血清Th1/Th2细胞因子INF-γ,IL-13可以预测放射性肺损伤的程度.