【摘 要】
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目的 平滑肌22α(SM22α)是平滑肌细胞(VSMC)骨架相关蛋白,参与VSMC骨架重构,与动脉粥样硬化、高血压等血管重塑性疾病与关.本研究旨在在SM22α基因内部引入LoxP序列,制备基于Cre/LoxP系统的SM22α条件性基因敲除小鼠,研究其在VSMC骨架重构中的作用机制.方法 利用CRISPR/Cas9技术编辑小鼠SM22α基因.在外显子1～2和3～4的非编码区各设计sgRNA位点并将其
【机 构】
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河北省实验动物重点实验室,河北医科大学实验动物学部 北京协和医学院比较医学中心,中国医学科学院医学
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目的 平滑肌22α(SM22α)是平滑肌细胞(VSMC)骨架相关蛋白,参与VSMC骨架重构,与动脉粥样硬化、高血压等血管重塑性疾病与关.本研究旨在在SM22α基因内部引入LoxP序列,制备基于Cre/LoxP系统的SM22α条件性基因敲除小鼠,研究其在VSMC骨架重构中的作用机制.方法 利用CRISPR/Cas9技术编辑小鼠SM22α基因.在外显子1～2和3～4的非编码区各设计sgRNA位点并将其定向克隆至pUC57-sgRNA.设计包含外显子2、3及2个LoxP序列且两侧各带有700bp同源臂的环状供体载体.Cas9的mRNA使用mMESSAGE mMACHINE(R) T7Ultra Kit进行体外转录,sgRNA使用线性化的spUC57-sgRNA重组质粒作为模板用MEGAshortscriptTM Kit体外转录合成.将制备好Cas9 mRNA、sgRNA和供体质粒进行混合,其浓度分别为Cas9 mRNA 25 ng/μl,sgRNA 10 ng/μl,供体质粒4 ng/μl.水平显微注射法将其导入170枚C57BL/6×B6D2F1受精卵原核.将注射后存活的约140枚受精卵移植入5只当日见栓的假孕KM雌鼠输卵管中,得到17只子代小鼠,经PCR和测序筛选目标小鼠.结果 有一只小鼠等位基因的特定位点插入了LoxP序列,三只小鼠删除了SM22α基因的第2第3外显子.结论 借助CRISPR/Cas9技术得到了SM22α基因内部引入LoxP序列的小鼠和SM22α基因敲除小鼠,为研究SM22α在VSMC中的作用机制提供了重要实验条件.
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