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目的在我国结肠癌为最常见恶性肿瘤之一,死亡率居第5位,死亡的患者有2/3存在肝转移。尽管近年来以手术为主的综合治疗方法已明显改善了结肠癌治疗效果,然而化疗耐药、复发、转移,尤其是肝脏转移,仍然没有被克服。因此,迫切需要寻找一种新的治疗方法降低结肠癌肝脏转移,改善结肠癌病人预后。IL-6在多种肿瘤（包括结肠癌）中均高表达,且与肿瘤的恶性表型相关,因此我们考虑IL-6可能成为治疗结肠癌一个有用的新靶点。研究表明抗IL-6或IL-6受体的抗体作为单一用药不是很有效,迄今为止并没有发现有小分子靶向IL-6Rα/GP130信号为临床癌症治疗是有效的。近来研究发现三代选择性雌激素受体调节剂（SERM）bazedoxifene（BZA）通过抑制IL-6/GP130靶点在头颈部肿瘤和胰腺癌等肿瘤中具有抗癌活性,但对结肠癌治疗是否有效,目前还没有相关报道。乙酰肝素酶（heparanase,HPA）可促进肿瘤侵袭和转移,成为癌症转移治疗的靶点。HPA抗体（HPA-AB）可阻断HPA作用,有很好的临床应用前景。治疗结肠癌、改善预后关键是解决肝脏侵润和转移问题。在结肠癌中HPA也是高表达的,我们推测通过BZA抑制IL-6/GP130靶点可以减少肿瘤侵袭和转移,干扰抑制HPA表达也可以抑制肿瘤侵袭和转移。如果把两者联合,从不同方面同时抑制肿瘤侵袭和转移,将可能很好的改善结肠癌的治疗效果,同时也进一步探讨结肠癌肝脏转移机制,为BZA和HPA-AB转化到临床奠定了理论实践基础,具有重要的临床意义。方法采用CCK-8、MTT和细胞克隆实验检测BZA、IL-6、5-FU、AG490、AZD6244、LY294002和HPA-AB等单独或联合处理方法对LoVo、HT29、SW480和HCT116四株结肠癌细胞的增殖抑制作用;通过transwell实验和划痕损伤实验检测细胞侵袭和迁移能力;使用流式细胞仪检测细胞周期和凋亡;qPCR检测BZA单独或联合其它多种处理方法对Ki-67、Bad和Bcl-2mRNA表达的影响;Western Blot（WB）法检测Bad、Bcl-2、STAT3、P-STAT3（Tyr705）、AKT、P-AKT（Ser473）、ERK、P-ERK（Thr202/Tyr204）和HPA等蛋白的表达变化;AG490、NVP-BEZ235、LY294002、AZD6244、Rapamycin,Bay,BZA,以及IL-6R抗体（IL-6R-AB）等多种方法处理细胞后,qPCR和WB检测Ki-67、Bad、Bcl-2和HPA等表达变化。分别采用siRNA干扰技术沉默HPA基因表达（siRNA组）,HPA-AB中和HPA（HPA-AB组）及外源性重组HPA（RE-HPA组）和BZA单独或者联合处理细胞观察细胞侵袭和迁移能力改变;ELISA法检测IL-6和HPA表达变化。建立裸鼠皮下结肠癌移植瘤模型,再次评估BZA和HPA-AB等联合治疗效果;HE染色观察BZA等多种处理方法对组织器官细胞毒性;免疫组化法检测Ki-67、P-STAT3、P-AKT、P-ERK和GP130等蛋白表达变化,TUNEL法检测移植瘤组织细胞凋亡。结果1.Bazedoxifene抑制结肠癌生物学活性及机制研究。在一定范围内BZA呈浓度和时间依赖性抑制HT29、HCT116、SW480和LoVo四株结肠癌细胞生长。BZA抑制细胞增殖与下调Ki-67 mRNA的表达相关,BZA呈剂量依赖性抑制了结肠癌细胞侵袭迁移能力。BZA诱导HT29和SW480结肠癌细胞周期停滞在G2/M期,两细胞凋亡率分别是19.4%±2.49%和26.0%±1.97%,而在DMSO对照组中HT29和SW480细胞凋亡率分别是2.03%±0.23%和2.68%±0.52%,表明BZA可诱导结肠癌细胞凋亡和周期停滞。qPCR和WB结果显示BZA上调Bad的表达,下调Bcl-2的表达,揭示了在结肠癌治疗中BZA诱导细胞凋亡与Bad/Bcl-2信号通路密切相关。进一步WB分析结果显示,与DMSO对照组比较,BZA抑制了GP130、P-STAT3（Tyr705）、P-AKT（Ser473）和P-ERK（Thr202/Tyr204）表达。细胞增殖实验显示与IL-6/BZA联合处理组比较,在BZA单独处理组明显的抑制了细胞生长（在HT29细胞IL-6/BZA vs.BZA,**P=0.0027;在SW480细胞IL-6/BZA vs.BZA,*P=0.0107）,两组相比差异具有统计学意义。而JAK/STAT3、PI3K/AKT/mTOR和Ras/Raf/MEK/ERK信号通路抑制剂AG490、LY294002、Selumetinib对细胞活力抑制能力明显低于BZA。体内实验显示BZA呈剂量依赖性抑制肿瘤生长,诱导肿瘤组织细胞凋亡而没有增加组织器官毒性。免疫组化显示在BZA高剂量组中Ki-67、GP130、P-STAT3、P-AKT和P-ERK蛋白表达明显低于低剂量组和DMSO对照组。2.Bazedoxifene增加5-FU在结肠癌中抗肿瘤活性研究。BZA与5-FU联合明显降低了5-FU的IC50值,两者抗肿瘤活性成协同作用。BZA增加了5-FU对结肠癌细胞增殖,侵袭和迁移能力抑制作用。在HT29和SW480细胞,5-FU/BZA联合组诱导细胞凋亡率分别是32.2%±4.14%和40.4%±2.63%,明显高于BZA单独处理组（在HT29和SW480细胞凋亡率分别是7.71%±1.22%和13.7%±2.18%）和5-FU单独处理组（在HT29和SW480细胞凋亡率分别是12.8%±2.54%和22.8%±3.20%）。与5-FU单独处理组相比,BZA和5-FU联合治疗组细胞周期停滞在G2/M期更加明显,在HT29细胞5-FU vs.BZA+5-FU,**P=0.0089;在SW480细胞5-FU vs.BZA+5-FU,**P=0.0033,两组相比差异具有统计学意义。qPCR和WB结果显示BZA增加5-FU诱导细胞凋亡部分地与Bad/Bcl-2信号通路相关。进一步机制研究发现BZA通过下调IL-6/GP130靶点及抑制下游效应子AKT、ERK和STAT3磷酸化水平增加了5-FU抗肿瘤活性,而IL-6通过激活IL-6/GP130靶点和上调P-AKT、P-ERK和P-STAT3水平可部分逆转5-FU抗肿瘤活性。体内实验进一步验证了5-FU抗肿瘤活性能被BZA增强。3.Bazedoxifene联合HPA抗体对结肠癌的治疗作用。HPA-AB对HT29、HCT116、SW480和LoVo四株结肠癌细胞增殖无明显影响。siRNA组和HPA-AB组明显抑制结肠癌细胞的侵袭和转移,而RE-HPA组明显促进了细胞的侵袭和迁移,表明HPA对结肠癌细胞侵袭和转移起促进作用。此外,BZA/HPA-AB联合组比单独处理组更加明显地抑制了细胞侵袭和迁移。体内实验进一步验证BZA/HPA-AB联合组比单独处理组和对照组更加明显地抑制了肿瘤的肝脏和肺脏转移。ELISA检测发现在siRNA组和HPA-AB组IL-6表达明显减少,而在RE-HPA组IL-6表达明显增加;相反在IL-6处理组HPA表达明显增加,且在一定范围内呈剂量依赖性。LY294002抑制了IL-6分泌和释放,在LY294002处理组HPA表达也明显降低。WB结果显示IL-6可刺激HPA表达,在一定范围内呈剂量依赖性;而IL-6R-AB和BZA处理组HPA表达明显降低。IL-6通过它介导的下游信号级联通路调控HPA表达,其中最主要的可能是通过PI3K/AKT和NF-κB信号通路。结论1.三代SERM BZA在结肠癌通过阻断IL-6/GP130靶点及抑制JAK/STAT3、PI3K/AKT/mTOR和Ras/Raf/MEK/ERK信号通路显示抗肿瘤活性。BZA诱导细胞凋亡与Bad/Bcl-2信号通路密切相关。BZA是一个有效的多信号通路抑制剂,其作用明显优于单信号通路抑制剂。2.BZA增加5-FU在结肠癌的抗肿瘤活性及敏化肿瘤细胞对化疗药物反应,是通过阻断IL-6/GP130靶点及抑制下游信号通路。相反IL-6通过激活IL-6/GP130靶点能够部分逆转BZA作用,表明了抑制IL-6/GP130信号轴可以增强5-FU抗肿瘤作用。3.HPA-AB对结肠癌细胞增殖无影响。BZA联合HPA-AB明显抑制结肠癌细胞的侵袭和转移能力,两者联合治疗结肠癌起协同抑制作用。在一定范围内IL-6可刺激HPA表达,反过来HPA也可增加IL-6表达,形成一个正反馈环路,促进肿瘤转移。IL-6通过它介导的下游信号级联通路调控HPA表达,其中最为关键的可能是通过PI3K/AKT和NF-κB信号通路。