论文部分内容阅读
背景:神经管畸形(Neural tube defects,NTDs),是指胚胎在早期发育过程中,中枢神经系统在病因和诱因的作用下,由于神经管闭合不全所引起的一组常见的出生缺陷,包括先天性无脑畸形、脊柱裂、脑膨出等。NTDs是出生缺陷中发病和死亡率最高的疾病,其发病有明显的地区及种群差异。发达地区和国家的发病率相对较低,通常在0.6‰以下。中国是NTDs高发国家,尤以山西省发生率最高,研究报道,2014年山西省NTDs发生率已高达3.15‰,甚至个别地区已达到20‰。印迹基因是目前发现的一类特殊的受表观修饰调控发挥作用的基因簇。目前,已证实人的印记基因超过200个,小鼠的印记基因超过140个。大量的研究表明,许多的印记基因对胚胎和胎儿出生后的生长发育有着重要调节作用。印记基因也是一类对叶酸等一碳营养素敏感的表观调控基因,对于早期营养因素有增强的表观遗传不稳定作用。在发育过程中,营养和其他环境刺激物可能会诱导基因组印记基因表观遗传修饰的持续改变。DNA甲基化修饰在印记基因的调控过程中扮演着重要角色,除此之外导致基因印记产生的表观遗传修饰还包括组蛋白修饰及非编码RNA调控等。此外,与神经管畸形相关性最密切的印迹基因是胰岛素样生长因子2(insulin-like growth factor 2,IGF2),该基因是最早发现的内源性印迹基因。IGF2是一种多功能细胞增殖调控因子,在细胞的分化,增殖、胚胎的生长发育以及肿瘤细胞增殖中具有重要的促进作用。IGF2是一种母源性印迹基因主要是促进胎儿生长和胚胎发育,它的印记缺失将到导致胎儿宫内生长发育迟缓。Lau和Liang等人研究证实miR-129可能在延髓和尾部神经组织中具有区域特异性作用。此外,miR-129在人体脑神经组织中是高表达,在其他组织中低表达。2011年liu等也证明miR-129可以通过Wnt-β-catenin蛋白抑制Gsk3b(一种Wnt信号传导的抑制剂)的表达,导致小鼠中脑和小脑畸形,进一步指出miR-129对NTD的病因学有重要意义。但miR-129-1与IGF2之间的调控关系以及具体机制尚不清楚,有待进一步研究。基于以上理论依据,本课题拟从胚胎干细胞水平研究印记基因IGF2的甲基化表达水平以及其与miR-129-1之间的调控关系。目的:miR-129-1在胚胎生长发育中发挥着重要作用,本课题拟探讨胚胎干细胞中miR-129-1与IGF2之间的调控关系。材料和方法:利用MassA RRAY技术进行PCR扩增,转录,检测印记基因IGF2甲基化水平;利用LC-SM质谱检测SAM、SAH、SAH/SAM、THF、CH2-THF等代谢产物水平;westernblot检测IGF2和miR 129-1的蛋白表达量;在胚胎干细胞水平利用流式细胞仪分析并比较各细胞的增殖Edu、凋亡Bcl-2、P53水平;qt-PCR验证印迹基因IGF2的表达和miR-129-1的表达量及其调控关系。结果:1.在胚胎干细胞中转染miR-129-1 mimic后,细胞的增殖能力增加,转染miR-129-1 inhibitor后,细胞的增殖能力降低,结果表明miR-129-1介导的IGF2表达的下调明显促进了胚胎干细胞的增殖能力;2.胚胎干细胞给予乙硫氨酸干预、PBS液对照后,MassA RRAY检测结果显示较对照组,乙硫氨酸干预组IGF2甲基化水平水平下降,LC-SM质谱检测SAM、SAH、SAH/SAM、THF、CH2-THF等代谢产物水平降低,具有统计学意义(p<0.05);3.在胚胎干细胞水平上,行westernblot检测,结果显示较对照组,乙硫氨酸干预组IGF2蛋白水平降低,PCR检测显示IGF2水平下降、miR-129-1的表达量升高;4.在胚胎干细胞水平利用流式细胞仪分析结果显示Bcl-2、P53水平升高。结论:miR-129-1通过靶向调节IGF2来影响乙硫氨酸诱导的NTDs的增殖、凋亡水平,且miR-129-1与IGF2之间存在负调节关系,表明一碳单位代谢障碍可能通过miR-129-1靶向调节IGF2导致NTDs的形成。