用RNAi抑制Cbfal表达阻断软骨细胞肥大分化治疗骨关节炎

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[目的]构建沉默SD大鼠核心结合因子(core binding factorα1,Cbfa1)基因的腺病毒(Ad-Cbfa1-siRNA),探讨利用RNA干扰(RNA interference,RN Ai)技术来抑制核心结合因子表达,从而阻断软骨细胞肥大分化,达到预防骨关节炎目的。[方法](1)利用Ambion的siRNA在线设计工具设计SD大鼠Cbfa1特异的siRNA,并用BLAST排除那些和其他编码同源序列/EST同源序列。人工合成Cbfa1特异的siRNA干扰序列,将其克隆到质粒上面,经酶切分析,目的基因均正确插入质粒中,后将质粒转移至腺病毒骨架中,转染HEK 293细胞,行腺病毒扩增;(2)培养SD大鼠膝关节软骨细胞,并使用番红0染色及Ⅱ型胶原免疫组化染色来完成软骨细胞的鉴定,之后利用维甲酸及IL-1仪促进软骨细胞肥大分化,利用X型胶原免疫组化染色进行进行鉴定;(3)分别利用Ad-Cbfa1-siRNA及阴性对照病毒感染正常的软骨细胞,后维甲酸及IL-1α作用于软骨细胞。利用Ⅱ型胶原、X型胶原免疫组化的方法以及RT-PCR比较各组之间Cbfa1的表达情况来分析软骨细胞的肥大分化情况;(4)采用用Hulth法建立SD大鼠右侧膝关节创伤性骨关节炎模型。24只SD大鼠随机分为4组,包括早期预防-实验组、早期预防-阴性对照组、中期治疗-实验组、中期治疗-阴性对照组,对侧膝关节作为正常对照组。在早期预防组中将病毒注射入关节大鼠右侧关节腔,1周后行手术。在中期治疗组中,术后1月将病毒注射人大鼠关节腔。利用Ad-Cbfa1-siRNA来预防骨关节炎的发生和观察其对骨关节炎的治疗效果,并运用X线、MRI、组织学以及免疫组化来评价结各组的结果。[结果]在体外实验部分,RT-PCR显示,软骨细胞经维甲酸和IL-1α作用后,与未使用维甲酸和IL-1α的软骨细胞相比,Cbfa1的表达量明显增加,经统计学分析,P<0.05,具有统计学意义。阴性对照病毒组Cbfa1的表达量明显高于Ad-Cbfa1-siRNA组,经统计学分析,P<0.05,具有统计学意义。[结论]在体外利用RNAi技术能够明显的抑制Cbfa1的表达,从而阻断软骨细胞的肥大分化。在动物模型中,利用RNAi技术能够减少关节软骨的破坏,可以预防骨关节炎的发生。
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