【摘 要】
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目的通过基因克隆在巴斯德毕赤酵母中表达人自身抗原组氨酰转移核糖核酸合成酶(HRS或Jo-1)。方法 PCR扩增Jo-1基因,与酵母表达载体pPIC9k重组,构建表达质粒 pPIC9k-Jo-1。用
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目的通过基因克隆在巴斯德毕赤酵母中表达人自身抗原组氨酰转移核糖核酸合成酶(HRS或Jo-1)。方法 PCR扩增Jo-1基因,与酵母表达载体pPIC9k重组,构建表达质粒 pPIC9k-Jo-1。用电穿孔法转化酵母菌SMD1168,在MD平板上筛选重组克隆,用G418快速筛选高拷贝转化子,阳性克隆经甲醇诱导表达后,培养上清用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE)和免疫酶斑点法(immunodot)鉴定。结果 PCR产物约为1 500 bp,与预期1 526 bp接近,pPIC9k-Jo-1重组阳性克隆测序结果与GenBank核酸数据库报道完全一致,双酶切鉴定正确。表达产物Jo-1的分子量约50 000,高拷贝毕赤酵母转化菌的表达水平明显高于低拷贝的,表达量占分泌总蛋白60％以上,产物浓度为800-900mg/L。免疫酶斑点法证实表达产物具有天然 Jo-1分子的免疫原性。阴性对照菌未见目的表达条带。结论Jo- 1在巴斯德毕赤酵母中获得高效分泌表达,为下一步研究打下了基础。
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