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随着化疗技术的进步,癌症患者的长期生存率不断提高,女性肿瘤患者接受化疗后的不良反应备受关注,其中包括卵巢早衰(premature ovarian failure,POF)和不孕不育.研究显示,化疗损伤卵巢功能主要通过直接诱导成熟卵泡凋亡和过度激活始基卵泡启动募集两种途径.2013年,Kalich-Philosoph等通过给小鼠腹腔注射环磷酰胺后发现其可致始基卵泡过度激活.始基卵泡是卵巢的基本生殖单位,其数目决定着女性的生殖潜能和生育期限.目前始基卵泡启动募集的具体机制尚不明了,对此深入探讨有助于增强对卵巢早衰、不孕不育等疾病的认识.雷帕霉素作为m-TOR通路的抑制剂,已被发现可抑制PETN基因敲除鼠始基卵泡的过度激活,减少始基卵泡的消耗,从而有助于卵巢储备功能的维持.目前的研究主要集中于雷帕霉素对始基卵泡激活的抑制作用,缺乏其在化疗中对始基卵泡影响的相关研究.随着对雷帕霉素在卵巢中作用机制的不断探索,希望其能在化疗所致的卵巢早衰的防治中带来新的应用前景,以及在延缓卵巢衰老方面带来新的契机.我们的科学问题是:环磷酰胺是否通过PI3K/AKT/M-TOR信号通路导致始基卵泡过度激活?而雷帕霉素对环磷酰胺所致始基卵泡过度激活是否有抑制作用从而保护卵巢储备池?
研究目的:观察环磷酰胺对小鼠卵巢各级卵泡生长凋亡的影响,并且探索雷帕霉素对化疗致卵巢内各级卵泡增殖、凋亡及相关信号通路的影响.雷帕霉素给药后血浆AMH水平，处死小鼠的同时眼球取血行ELISA检测血浆AMH水平,结果显示环磷酰胺化疗后小鼠血浆AMH水平有降低趋势,但各不同剂量组的AMH水平之间比较没有统计学差异,而给药4周后AMH水平明显降低,差异有统计学意义(P＜0.05).而给药4周组同时添加雷帕霉素后AMH水平降低不明显,差异无统计学意义(P＞0.05).雷帕霉素单独给药不会影响AMH水平.
研究方法:选取8周龄雌性BALB/e小鼠,随机分为环磷酰胺组(CY)、雷帕霉素组(RAPA)、环磷酰胺+雷帕霉素联合给药组、空白对照组,每组30只,腹腔注射给药.行ELISA检测血浆AMH水平;HE染色行形态学分析,分类统计各组各级卵泡计数;行TUNEL和Ki67检测卵泡凋亡和增殖情况;最后行免疫组化和免疫荧光及Western Blotting检测信号通路表达情况.
研究结果:1.HE染色结果发现环磷酰胺单次给药会导致卵巢内各级卵泡明显减少,始基卵泡的减少比早期生长卵泡的减少更为明显.且随着环磷酰胺给药剂量的增加早期生长卵泡和始基卵泡的比值呈上升的趋势,给药4周组比例上升更加明显(P＜0.05).而雷帕霉素能有效降低环磷酰胺致始基卵泡的减少,给予雷帕霉素后早期生长卵泡与始基卵泡的比值降低(P＜0.05).2.TUNEL结果显示随着环磷酰胺给药时间和剂量的增加,窦卵泡颗粒细胞凋亡较PBS对照组明显增加,不同给药时间组均未发现始基卵泡存在凋亡.而CY+RAPA组较CY组成熟窦卵泡的颗粒细胞凋亡明显减少.3.Ki67结果发现环磷酰胺组不仅成熟卵泡的颗粒细胞存在增殖,其早期生长卵泡的颗粒细胞也有表达;而对照组主要在成熟卵泡颗粒细胞着色.4.免疫组化和免疫荧光结果显示CY组p-AKT,p-mTOR,p-rps6在早期生长卵泡的颗粒细胞中均存在表达.5.Western Blot结果显示AKT,m-TOR的磷酸化水平有所增加,但无统计学差异,而rpS6磷酸化水平明显增加(P=0.025);而添加雷帕霉素后P-AKT/AKT与p-mTOR/mTOR的比值在各组间无显著性差异,而p-rpS6的磷酸化水平比单独环磷酰胺组明显降低(P=0.001).6.ELISA检测血浆AMH水平发现环磷酰胺单次不同剂量组没有统计学差异,而给药4周组AMH明显降低(P＞0.05).而给药4周组添加雷帕霉素后AMH降低不明显,但结果无统计学差异(P＞0.05).
研究结论:1.环磷酰胺可导致成年鼠卵巢内各级卵泡数减少,该作用可能与PI3K/AKT/m-TOR信号通路有关.2.环磷酰胺可诱发始基卵泡过早启动募集进入生长卵泡池.3.雷帕霉素可降低环磷酰胺对卵巢内各级卵泡的促凋亡作用.4.雷帕霉素可抑制环磷酰胺诱导的早期生长卵泡与始基卵泡比值的增加,说明其对环磷酰胺诱导的始基卵泡过度激活有一定的抑制作用.5.雷帕霉素通过抑制M-TOR位点降低环磷酰胺对小鼠卵巢储备功能影响.