【摘 要】
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目的:在大肠杆菌中建立一个能够生物合成紫杉烯(紫杉醇生物合成的第一个重要中间体)的代谢途径.方法:利用PCR、SOE-PCR和常用的分子生物学技术进行基因的克隆、拼接和亚克隆
【出 处】
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第七届全国青年药学工作者最新科研成果交流会
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目的:在大肠杆菌中建立一个能够生物合成紫杉烯(紫杉醇生物合成的第一个重要中间体)的代谢途径.方法:利用PCR、SOE-PCR和常用的分子生物学技术进行基因的克隆、拼接和亚克隆等基因操作,进而构建了多个融合表达载体.结果:为进行代谢途径工程研究,构建了一个在大肠杆菌中以荧光蛋白为标记的通用基因表达检测载体pHis-EGFP,并检测到用于代谢途径工程的4个重要基因都得以正常表达.该载体可见的绿色荧光可以直观地观察融合基因表达状况,也使得用亲和层析、离子交换层析和分子筛层析纯化蛋白更方便易行;在整个蛋白纯化过程中,可以省略每一次纯化所需的SDS-PAGE分析,大大地提高了工作效率.为建立紫杉烯生物合成途径,克隆了大肠杆菌的DXP合酶、IDP异构酶基因及酵母的GGDP合酶基因,构建多个重组质粒,并最终构建成2个融合表达的基因串联体pDXS/TS和pAIG.同时,利用构建的2个含有绿色荧光蛋白报告基因的表达载体对所构建的融合基因的启动子进行了功能表达鉴定,还利用SDS-PAGE分析了每个融合基因的表达情况.完成了2个融合表达的基因串联体pDXS/TS和pAIG的大肠杆菌转化,即获得了具有完整的能够生物合成紫杉烯途径的工程菌.结论:构建了一个以荧光蛋白作为报告基因的表达检测系统,4个基因都得以正常表达.在大肠杆菌中构建了一个能够合成紫杉烯的生物合成途径.
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