【摘 要】
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鸡β-防御素-6是鸡体内免疫系统抵御外界微生物侵害的重要肽类物质,为了研究二硫键对鸡β-防御素生物学活性的影响,并实现鸡β-防御素-6(AvBD-6)的真核表达,将其成熟区的
【机 构】
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东北农业大学动物营养研究所,哈尔滨150030
【出 处】
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中国畜牧兽医学会动物营养学分会第十一次全国动物营养学术研讨会
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鸡β-防御素-6是鸡体内免疫系统抵御外界微生物侵害的重要肽类物质,为了研究二硫键对鸡β-防御素生物学活性的影响,并实现鸡β-防御素-6(AvBD-6)的真核表达,将其成熟区的全部半胱氨酸去掉,获得衍生物AvBD-6-B.根据毕赤酵母密码子偏爱性,设计了AvBD-6和AvBD-6-B的基因片段,插入到真核表达载体pGAPHαM的Xho Ⅰ和EcoR Ⅰ酶切位点之间,构建重组表达质粒.将重组表达载体用BglⅡ线性化回收大片段后电击转化到毕赤酵母GS115中,转化产物涂布MD平板,30℃培养3～4天,直到长出单菌落.利用PCR筛选阳性克隆,并将阳性重组子接种于100ml YPD(含有1％酪蛋白水解物)培养基中表达,分别于48h、72h和96h取样经TCA处理后进行Tricine-SDS-PAGE检测.结果显示示在5.8kDa和7.8kDa之间有特异性条带,略大于理论计算值5.6ku和4.9ku,原因是多肽所含氨基酸数目少,且含有较多极性氨基酸(酸性或碱性),从而影响了其在聚丙烯酰胺凝胶电泳中条带的迁移率,使得表观分子量和多肽的氨基酸理论推算分子量有一定差距.由此可见,AvBD-6和AvBD-6-B在毕赤酵母中得到了表达,用考马斯亮蓝法测定表达量分别为114.9mg/L和93.8mg/L.最小抑菌浓度(MIC)试验结果表明,两者对鼠伤寒沙门氏菌C77-31、鸡白痢沙门氏菌C79-13和表皮葡萄球菌ATCC12228的MIC值为10.6 μg/ml,对金黄色葡萄球菌的MIC值为2.7μg/ml,且二者均无溶血活性.结果提示去掉二硫键对鸡β-防御素的生物学活性没有负面影响.这为利用基因工程技术实现抗菌肽工业化生产提供了理论依据.
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