【摘 要】
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目的：构建人磷脂磷酸水解酶3(hLJPP3)基因的真核表达载体pLenExpress-hLJPP3，并转染卵巢癌细胞系sKOV3细胞，初步观察重组表达载体对卵巢癌细胞的转染效率、目的基因表达情况以及对卵巢癌细胞生长的影响。方法：采用RT-PCR法从正常胎盘组织中提取hLPP3基因，先克隆入克隆载体pGEM-T easy质粒得到pGFM-T-hLPP3，再用BamHⅠ和Xho进行双酶切，切下的hLP
【机 构】
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郑州大学第一附属医院妇产科 450052 郑州大学基础医学院微免教研室
【出 处】
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2008年全国妇产科围手术期相关问题及治疗并发症学术研讨会
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目的：构建人磷脂磷酸水解酶3(hLJPP3)基因的真核表达载体pLenExpress-hLJPP3，并转染卵巢癌细胞系sKOV3细胞，初步观察重组表达载体对卵巢癌细胞的转染效率、目的基因表达情况以及对卵巢癌细胞生长的影响。
方法：采用RT-PCR法从正常胎盘组织中提取hLPP3基因，先克隆入克隆载体pGEM-T easy质粒得到pGFM-T-hLPP3，再用BamHⅠ和Xho进行双酶切，切下的hLPP3基因亚克隆入真核表达载体pLenExpress，得到pknExpress-hLPP3重组质粒。采用脂质体转染法转染卵巢垃细胞系SKOV3细胞，荧光显微镜观察细胞转染效率，实时荧光定量PCR法检测hLPP3 mRNA的表达，化学法测定转染前后细胞上清液中LPA含量变化，流式细胞仪检测细胞周期及凋亡情况。
结果：重组表达质粒经限制性酶切鉴定得到与hLPP3基因长度一致(936bp)的酶切产物，测序分析证实，目的基因序列GenBank上登录的hLPP3基因(Bc009196)序列完全一致。实验分为实验组A(转染表达hLPP3基因重组质粒)、空质粒对照组B(转染空表达质粒)和无转染对照组C。荧光显微镜下见A、B两绍SKOV3细胞内有大量绿色荧光信号，转染率分别为65％和67％，C组细胞中无荧光信号;实时荧光定量PCR测定显示实验组细胞中hLPP3 mRNA的相对表达量较两个对照组明显增加(3组分别为0.5109±0.05840、0.1499±0.02554、0.1433±0.01805，P<0.05);转染后实验组卵巢癌细胞上清液中的LPA含量较两个对照组明显下降[3组分别为(2.37±0.76)μmol/L、(6.71±2.03)μmol/L、(6.84±1.49)μmol/L，P<0.05];流式细胞仪检测转染后实验组卵巢癌细胞凋亡率明显增加(3组分别为30.50±2.12、1.26±0.43、0.10±0.03，P<0.05)，细胞周期无明显变化。
结论：成功构建了表达目的基因hLPP3的重组真核表达载体pLenExpress-hLPP3，并能高效转染卵巢癌细胞系SKOV3细胞，使细胞中hLPP3基因表达水平明显升高。增强hLPP3基因表达可以降低细胞外LPA水平，诱导细胞凋亡，抑制卵巢癌细胞的生长。
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