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目的:通过测定与分析多种内皮细胞分泌因子的水平,包括:细胞间粘附分子-1(intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)和血管细胞粘附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1,VCAM-1),一氧化氮(nitric oxide,NO),炎性因子白介素-6(Interleukin-6,IL-6)探索不同浓度Chemerin干预对基础水平的人脐静脉内皮细胞功能的影响及生理浓度的Chemerin对肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-alpha,TNF-α)诱导的血管内皮细胞损伤模型的影响.通过检测并分析细胞内生存关键通路磷脂酰肌醇3激酶途径中(Phosphatidylinositol 3-kinase/Akt,P 13 K/Akt)AKT,磷酸化AKT(p-AKT),内皮型一氧化氮合酶(Endothelial nitric oxide synthase,eNOS)及磷酸化内皮型一氧化氮合酶(p-eNOS)表达水平,探讨Chemerin的可能作用机制.
方法:1.培养人脐静脉内皮细胞-12细胞株(Human Umbilical Vein EndothelialCells-12,HUVEC-12),依据不同浓度的重组Chemerin分别干预24小时或48小时,共12组,Chemerin浓度(0,5,25,50,100,200ng/ml)分别为24小时①-⑥组,48小时⑦-(○12)组,应用Griess法测定细胞培养液上清液中NO水平;ELISA试剂盒检测细胞内IL-6、ICAM-1、VCAM-I水平.通过单因素方差分析及多重比较,得出Chemerin对基础水平的血管内皮细胞的影响,并结合既往资料与实验结果推算最适干预浓度与时间(浓度:Chemerin 100ng/ml,干预时间:24小时);2.Chemerin对TNF-a诱导的HUVEC-12细胞损伤模型的影响:设A为未加药物的空白对照组;B为Chemerin组:给予终浓度为(100ng/ml)Chemerin干预;C为TNF-a组给予终浓度为(50ng/ml)TNF-a干预;D为Chemerin+TNF-a组给予终浓度分别为100ng/mlChemerin+50ng/mlTNF-a干预:E为LY294002组,LY294002为P13K特异性抑制剂,给予终浓度分别为100nglmiChemerin+50ng/ml TNF-a+20μmol/LLY294002干预.于24小时应用上述方法检测细胞培养上清液中NO水平;HUVEC的IL-6、ICAM-1、VCAM-1水平,应用Real-time PCR检测各组HUVEC-12的AKTmRNA表达水平,Western Blot法测定AKT,p-AKT,eNOS,p-eNOS蛋白水平.通过统计学软件计算分析结果,以P<0.05为有统计学意义.
结果:1.Chemerin能上调HUVCE-12细胞培养上清液中的NO水平,并且在5ng/ml24小时即明显增高,其诱导作用在(0-100ng/ml )范围内呈浓度依赖((P<0.05),在25-200ng/ml浓度范围48小时组较24小时组增高无统计学意义(P>0.05),而5ng/ml组48小时组较24小时组NO的水平增高(P<0.05),各组IL-6、ICAM-1、VCAM-1之间相比无差异(P>0.05);2.Chemerin组较空白对照组,NO的水平明显上升(P<0.01),p-AKT、eNOS及p-eNOS的水平增加(P<0.01),对AKT蛋白及AKT mRNA的表达无影响(P>0.05):3.Chemerin+TNF-a组较TNF-a组IL-6、ICAM-1、VCAM-1、NO的水平均明显下降(P<0.01),p-AKT、eNOS及p-eNOS的水平增加(P<0.01),对AKT蛋白水平及AKTmRNA表达无影响(P>0.05);4.LY294002组较Chemerin+TNF-a组ICAM-1,VCAM-1,NO增高(P<0.05),IL-6未见明显改变(P>0.05),下调p-AKT(P=0.000),p-eNOS及eNOS蛋白表达(P<0.05),但对AKT蛋白水平及AKTmRNA表达无影响(P>0.05).
结论:1.Chemerin能抑制炎性损伤的血管内皮细胞分泌粘附分子和炎性分子,可能对损伤的内皮细胞具有保护作用;2.Chemerin可以上调NO的释放,以上作用与eNOS及p-eNOS活化有关,P13K/AKT-eNOS途径参与了上述作用;3.Chemerin对炎性损伤下的内皮细胞具有保护潜能,可成为动脉粥样硬化研究的靶点.