【摘 要】
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目的：探讨基于组织工程学的温敏神经干细胞联合亚低温对重型颅脑创伤(Severe Traumatic Brain Injury,sTBI)神经功能修复的作用.方法：构建携带tsSV40LT基因的慢病毒,转染表达GFP的神经干细胞,建立温敏神经干细胞(Temperature Sensitive Neural Stem Cells,tsNSCs)系,RT-PCR检测转染效率,流式细胞仪检测33℃和37℃
【机 构】
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武警后勤学院附属医院武警脑科医院,武警部队脑创伤与神经疾病研究所
【出 处】
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第二届中国医师协会神经损伤年会暨第二届天坛全国神经创伤学术研讨会
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目的：探讨基于组织工程学的温敏神经干细胞联合亚低温对重型颅脑创伤(Severe Traumatic Brain Injury,sTBI)神经功能修复的作用.方法：构建携带tsSV40LT基因的慢病毒,转染表达GFP的神经干细胞,建立温敏神经干细胞(Temperature Sensitive Neural Stem Cells,tsNSCs)系,RT-PCR检测转染效率,流式细胞仪检测33℃和37℃时的细胞周期,CCK-8检测33℃和37℃时的细胞活性,细胞免疫荧光检测33℃和37℃时增殖核抗原(PCNA)的增殖情况;混合10～40 mg/mL的纤维蛋白原溶液、50 U/mL抑肽酶和10～40 U/mL凝血酶溶液,置入37℃的恒温箱中,充分孵育10 rain,制备纤维蛋白支架,扫描电镜观察纤维蛋白支架的微观结构,检测支架的孔径、吸水性以及和细胞共培养后的生物相容性;采用液压冲击仪建立大鼠sTBI模型(2.4atm);实验分为5组:假手术组、TBI组、TBI+亚低温组、TBI+tsNSCs组和TBI+tsNSCs支架+亚低温组;损伤近缘4个位点注射总量为20μL,含有数量10(7)tsNSCs的纤维蛋白支架配方溶液，注射后立即采用亚低温治疗(小动物亚低温治疗仪，持续监测肛温33℃，持续48h，缓慢复温，速率为0.4℃/h);TBI前、TBI后1、3、7、14、28、56 d分别行单盲神经运动功能检测;TBI后第47 d开始单盲水迷宫训练，连续训练6d，每天1次，第7d和第9d进行检测;免疫荧光组织化学法和免疫电镜检测移植干细胞的存活、迁移、分化、突触和髓鞘的形成。结果：RT-PCR结果显示tsSV40LT转染成功;与37℃相比，tsNSCs在33℃时处于S期的比率显著增多，其细胞活性和PCNA的表达水平也显著增高;适宜脑组织和 NSCs纤维蛋白支架的最佳配比为20 mg/mL的纤维蛋白原溶液、50 U/mL抑肤酶和30 U/mL凝血酶溶液;亚低温治疗期间大鼠肛温维持在29.6℃～33.4℃，无明显副作用;与TBI组相比，TBI+tsNSCs支架+亚低温组神经运动功能和学习记忆能力的恢复显著增强，其NSCs的存活率、迁移能力、神经元分化比率和突触形成数量也显著增多。结论载温敏神经干细胞纤维蛋白支架移植联合亚低温治疗，可显著促进大鼠sTBI神经功能的修复。
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