外泌体穿梭microRNA-21在食管癌血管生成中的作用

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【目的】探讨食管癌细胞分泌的外泌体(exosomes)介导的microRNA-21(miR-21)在食管癌血管生成中的作用及其作用机制。【材料和方法】miR-21 mimics瞬时转染人脐静脉血管内皮细胞HUVECs 48h后,应用血管形成实验检测过表达miR-21对HUVECs血管生成能力的影响;应用生物信息学技术预测与血管生成功能相关的miR-21靶基因,分别采用QRT-PCR和Western Blot技术分析预测靶基因及其下游基因的mRNA和蛋白水平,一氧化氮(NO)测试盒检测HUVECs及其培养上清中的NO水平;通过建立稳定的体外供受体细胞培养模型,miR-21 mimics瞬时转染供体食管癌细胞株EC9706使其过表达miR-21,将其与受体细胞HUVECs共培养24h后,QRT-PCR检测受体细胞中miR-21表达水平,血管形成实验检测供受体细胞间非接触性细胞交流对受体细胞HUVECs血管生成能力的影响。【结果】miR-21 mimics直接转染HUVECs 48h后,HUVECs生成总血管长度、血管成环数、血管分支点数目分别是miR-NC组的2.11、4.83、2.13倍;QRT-PCR检测miR-21靶基因PTEN mRNA表达水平在miR-21组和miR-NC组中未见明显差异(p=0.89),PTEN下游基因基质金属蛋白酶MMP2 mRNA表达水平无明显变化而MMP9 mRNA表达水平下降了94.34%;Western Blot结果显示过表达miR-21后HUVECs中PTEN表达较miR-NC组降低了48.69%,其下游P-Akt(Ser473)的蛋白表达水平增加了27.27%、P-eNOS(Ser1177)和p-ERK1/2(Thr202/Tyr204)的蛋白表达水平分别下降了45.09%和42.38%,NO含量在HUVECs及其培养上清中均无明显差异(P值分别为0.07、0.51);供体细胞EC9706与受体HUVECs共培养24h后,受体细胞HUVECs中miR-21表达水平是miR-NC组的1.23倍,受体细胞HUVECs生成总血管长度、血管成环数、血管分支点数目分别是miR-NC组的1.12、1.17、1.17倍,其中MMP9mRNA的表达水平虽无明显差异(p=0.17)但有下降趋势,p-Akt(Ser473)的蛋白表达水平增加了2.79%,p-eNOS(Ser1177)和p-ERK1/2(Thr202/Tyr204)的蛋白表达水平分别下降了27.35%和24.70%,这与miR-21直接作用于HUVECs的结果趋势一致。【结论】外泌体穿梭miR-21可能通过细胞间通讯参与食管癌的发生发展,其可能通过PTEN/Akt/eNOS/NO途径促进食管癌肿瘤微环境中血管内皮细胞的血管生成,从而为食管癌组织的生长提供血供,这一机制的发现补充了传统的细胞间通讯理论,丰富了细胞间调控网络及外泌体穿梭miRNA在肿瘤微环境中的作用研究。
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