【摘 要】
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根据巨型艾美耳球虫Emgam56基因去除信号肽后的ORF序列和真核表达载体pPICzαA的酶切位点设计一对特异性引物,以本实验室保存的重组质粒pGEM-T-Emgam56为模板,PCR扩增出目的片段,插入表达载体pPICzαA中,构建重组表达质粒pPICzαA-Emgam56.对酶切鉴定和PCR鉴定为阳性的重组质粒进行测序,将连接正确的重组质粒线性化后用电穿孔法转化到毕赤酵母GS115,利用博莱霉
【机 构】
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扬州大学,兽医学院,江苏,扬州 225009
【出 处】
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中国畜牧兽医学会兽医寄生虫学分会第十三次学术研讨会
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根据巨型艾美耳球虫Emgam56基因去除信号肽后的ORF序列和真核表达载体pPICzαA的酶切位点设计一对特异性引物,以本实验室保存的重组质粒pGEM-T-Emgam56为模板,PCR扩增出目的片段,插入表达载体pPICzαA中,构建重组表达质粒pPICzαA-Emgam56.对酶切鉴定和PCR鉴定为阳性的重组质粒进行测序,将连接正确的重组质粒线性化后用电穿孔法转化到毕赤酵母GS115,利用博莱霉素(Zeocin)抗性筛选多拷贝重组菌株,摇瓶水平进行诱导表达,所得蛋白大小约为11.6 kDa,且能被6×HIS单抗识别.分别以鼠抗酵母表达蛋白rEmGam56多克隆抗体、鼠抗原核表达蛋白rEmGam56多克隆抗体和E.maxima鸡康复血清为一抗,对酵母表达蛋白rEmGam56进行Western-blot检测,结果显示该蛋白具有良好的免疫原性.以酵母表达蛋白rEmGam56为抗原,用间接ELISA方法检测鼠抗酵母表达蛋白rEmGam56多抗、原核表达蛋白rEmGam56多抗和鸡康复血清,显示该重组蛋白能刺激机体产生一定的抗体水平,并且能识别鸡康复血清中的特异性抗体.以雏鸡为试验动物,以死亡率、相对增重率、病变记分减少率与相对卵囊产量、细胞免疫和体液免疫水平等为评价指标,对酵母表达蛋白rEmGam56的免疫保护效果进行了初步研究,并与原核表达蛋白rEmGam56和卵囊的免疫效果相比较.结果显示：酵母表达蛋白高剂量组(60 μg/羽鸡)和原核表达蛋白高剂量组(300μg/羽鸡)的免疫效果最佳,但都低于卵囊免疫组；其中酵母表达蛋白高剂量组(60 μg/羽鸡)的免疫效果略低于原核表达蛋白高剂量组(300 μg/羽鸡).
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