【摘 要】
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为研究三疣梭子蟹抗溶藻弧菌的分子机理,研究克隆了三疣梭子蟹免疫相关基因C型凝集素(C-type-lectin),并对其与抗溶藻弧菌的相关性进行了研究.根据已报道的三疣梭子蟹C-type-lectin的eDNA序列,通过长片段PCR方法,得到了其基因组DNA全长序列,共有1473bp,5侧翼序列114bp,3侧翼序列233bp,ATG-TAA共1126bp,其中包括四个外显子和3个内含子.用溶藻弧菌
【机 构】
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浙江省淡水水产研究所,浙江湖州,313001;宁波大学海洋学院,浙江宁波,315211 宁波大学海
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为研究三疣梭子蟹抗溶藻弧菌的分子机理,研究克隆了三疣梭子蟹免疫相关基因C型凝集素(C-type-lectin),并对其与抗溶藻弧菌的相关性进行了研究.根据已报道的三疣梭子蟹C-type-lectin的eDNA序列,通过长片段PCR方法,得到了其基因组DNA全长序列,共有1473bp,5侧翼序列114bp,3侧翼序列233bp,ATG-TAA共1126bp,其中包括四个外显子和3个内含子.用溶藻弧菌进行三疣梭子蟹人工感染试验观察120h,收集早期时间内死亡蟹样品作为易感组,存活蟹作为抗性组,各组分别取33个样本作为测试对象.首先各组选5个样进行C-type-lectin基因扩增、克隆至PMD19-T,然后进行测序,共在其基因组内找到3个单核苷酸多态性(SNP)位点及一个三碱基的缺失位点,分别为第二内含子309bp处T-A突变(I2-309 T-A),第三内含子101bp处G-A突变,第四外显子205bp处T-C突变(E4-205 T-C)以及第三内含子102bp处AAC缺失.其中外显子的一个SNP为非同义cSNP,密码子变异(ACT-ATT)导致所编码氨基酸改变(Thr-Ile).针对SNP位点设计引物进行PCR扩增、测序各组样品,根据测序峰图统计分析I2-309 T-A及E4-205 T-C SNPs位点的基因型及等位基因,结果表明I2-309 T-A存在两种基因型T/A和A/A,在易感组的频率分别为66.7％ (22 T/A)和33.3％(11 A/A)；在抗性组的频率分别为87.9％ (29 T/A)和12.1％(4A/A),经SPSS卡方检验其相关性,差异显著(x2=4.227,P=0.040).而E4-205 T-C存在三种基因型T/C、T/T及C/C,在易感组的频率分别为54.5％ (18 T/C)、6.1％(2 T/T)和39.4％ (13 C/C)；在抗性组的频率分别为63.6％(21 T/C)、21.2％(7 T/T)和15.2％(5C/C),经SPSS卡方检验其相关性,差异显著(x2=6.564,P=0.038).结果表明,这两个SNP位点可作为三疣梭子蟹抗病育种的候选分子标记,还需进一步验证.
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