论文部分内容阅读
致病微生物引起的食源性疾病是全世界头号食品安全问题,它已经引起包括中国在内的众多国家的高度关注。据估计,食品致病微生物(细菌和病毒)每年导致美国7600万人感染疾病、32.5万人需住院治疗、以及5200人死亡,而且这种情况在发展中国家更加严重[1]。细菌致病微生物(例如单增李斯特氏菌、沙门氏菌以及副溶血弧菌等)感染的食品能引起许多严重的传染性疾病,而单增李斯特氏菌被认为是食品工业中最重要的一种食品致病菌,能在水果、蔬菜、蛋类、肉类等许多食品中得以发现。食用单增李斯特氏菌感染的食品能引起李斯特菌病(如脑膜脑炎、败血症等),病死率高达30%[2]。胃肠炎是人类最常见的一种疾病。大多数胃肠炎是由病毒引起,其中轮状病毒和诺瓦克病毒是引起这种疾病的最主要的2种致病微生物。粪-口途径是轮状病毒和诺瓦克病毒感染的主要传播方式,也可以通过污染的水源、食品和物品和空气等传播。病人的呕吐物和粪便可形成气溶胶,与病人接触可传染;病人的呕吐物和粪便在自然界中污染水或间接污染食品,很容易造成暴发。目前,传统的食品致病细菌检测法有平板培养、免疫、聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)等;传统食品致病病毒的检测方法有电镜观察、细胞培养、核酸杂交、酶联免疫及PCR等。然后,所有这些传统的食品致病细菌和病毒的检测方法一般都需要较长的检测时间、较大的试剂样品消耗和/或较低的检测灵敏度。为了克服这些缺点,本文介绍一种集DNA富集或RNA反转录样品制备、连续流动PCR以及在线荧光分析的微流控技术来快速检测食品致病微生物,包括轮状病毒、诺瓦克病毒以及单增李斯特氏菌。微流控装置是以加热铜块组成恒温带,以聚四氟乙烯毛细管微通道为反应体系构建而成。为了充分体现PCR微流控技术的优越性,在线荧光分析被用于检测PCR产物,从而大大缩短了检测所需的分析时间。在集成化的RT-PCR微流控装置上,1 h可完成病毒RNA的RT-PCR以及其扩增产物的在线荧光分析,样品检出限达到6.4×104 copies/μL。另外,利用单相连续流动巢式PCR(single-phase continuous-flow nested polymerase chain reaction,SP-CF-NPCR)和在线荧光分析的集成化微流控技术,样品检出限低至0.2 copies/μL的单增李斯特氏菌基因组DNA能在42 min内完成检测。据我们所知,在至今为止报道的单相连续流动PCR微流控系统中,我们所开发的SP-CF-NPCR技术取得的检测灵敏度最高。因此,这些研究为食品致病微生物的快速、高灵敏度检测提供了新的生化检测工具,有着现实的应用意义。