【摘 要】
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这些年来,基因工程受到国内外学者们关注,开始利用微生物体系来得到异源酶蛋白.其中E.coli广泛用于工业化生产各种异源蛋白,因其工程菌株遗传背景研究透彻,易培养,等特点,成为酶生产的最佳选择之一.海藻糖甜度可口,性质稳定,无还原性一系列特性,在食品加工业、医药行业、化妆品产业中广泛应用.在海藻糖大量生产中,海藻糖合酶可催化麦芽糖,直接得到海藻糖.此途径简单,快捷,成本廉价,有利于工业化大规模生产.
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这些年来,基因工程受到国内外学者们关注,开始利用微生物体系来得到异源酶蛋白.其中E.coli广泛用于工业化生产各种异源蛋白,因其工程菌株遗传背景研究透彻,易培养,等特点,成为酶生产的最佳选择之一.海藻糖甜度可口,性质稳定,无还原性一系列特性,在食品加工业、医药行业、化妆品产业中广泛应用.在海藻糖大量生产中,海藻糖合酶可催化麦芽糖,直接得到海藻糖.此途径简单,快捷,成本廉价,有利于工业化大规模生产.所以比起其它海藻糖合成酶,海藻糖合酶具有很多优点.本课题也是从这个角度出发,在分子生物学领域对其进行研究.先是从E.coli表达异源酶蛋白转录水平入手,通过在E.coli中利用不同启动子和不同拷贝数的质粒表达不同来源的海藻糖合酶,较有代表性选择了三种常温来源和两种嗜热来源TreS基因,系统地对该基因工程体系与海藻糖合酶进行研究与探索,筛选出高效表达海藻糖合酶的重组大肠杆菌,分别构建在大肠杆菌中的不同特性的载体上,通过比较这几种克隆,筛选最佳的海藻糖合酶表达调控状态,摇瓶发酵最高酶活为2614 U,比酶活为1.996U·mg-1,并确定最佳发酵条件:发酵30 h、温度16 ℃、IPTG终浓度0.5 mM·L-1、乳糖终浓度1.5 mM·L-1.最佳酶促反应条件:酶反应温度50 ℃、酶反应时间10 h、麦芽糖100g/L,酶反应pH=9.0.Ca2+添加量15 mM·L-1,酶活提高19％,抗败血酸和二硫苏糖醇添加量4 mM·L-1,酶活分别提高9.4％和41％.为促使海藻糖合酶进行胞外分泌,避免提取纯化减少酶损失,本论文尝试敲除大肠杆菌宿主编码膜蛋白的lpp基因,使海藻糖合酶分泌到胞外,发酵液上清反应产海藻糖浓度增加1.48倍,菌体破碎反应产海藻糖量有所下降.利用分泌信号肽YebF与tttreS基因融合表达,发酵液上清反应产海藻糖浓度提高77.91％,发酵液上清和菌体破碎后反应总海藻糖浓度提高23.45％.为减少海藻糖合酶表达形成无活性的包涵体,提高可溶性蛋白量.采用降低诱导表达温度、更换较弱的重组质粒上的启动子和RBS序列和分子伴侣sigma32、GroEL/S和DnaK/J共表达的方法,其中三种分子伴侣组合与海藻糖合酶共表达的形式比原始菌株提高12倍.并且根据海藻糖合酶结构同源模型建立,探索酶催化活性中心和底物专一性周围的关键性氨基酸,利用点突变技术和C端嗜热基因改造提高海藻糖合酶酶活.常温来源的TreS与嗜热细菌来源的tttreS的C端基因融合表达,C端嗜热部分对海藻糖合酶催化中心的结构产生作用,使得恶臭假单胞菌pptreS比原始菌株提高2.53倍,谷氨酸棒杆菌cgtreS比原始菌株提高5.58倍,天蓝色链霉菌sctreS比原始菌株提高2.74倍,海栖热袍菌tmtreS比原始菌株提高4.57倍.利用点突变对海藻糖合酶催化活性中心周围的几个氨基酸进行突变,通过纯化后测定比酶活测得V95A、I96A,S105A,H108A和I96E对比酶活产生影响,比酶活相比原始菌株最高可提高1.54倍.
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