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生物钟是昆虫生命周期中重要的调控机制,对昆虫的生长发育、各种行为活动,生理代谢都有重要的调节作用。鳞翅目昆虫的生物钟核心成员和调节机制与哺乳动物不同。本研究室前期研究已经证明,家蚕的生物钟系统参与到家蚕的滞育、孵化、羽化等生理过程,生物钟基因Cry1、Cry2、Per在家蚕BmN卵巢细胞系中呈现周期性表达,对光照和温度授时变化有所相应。本文通过对BmN在基因组中插入同源双链DNA的方法,获得持续性干涉生物钟核心基因的细胞系,并对其进行调查,主要结果如下:敲降细胞系的获得:通过设计Cry1、Cry2、Per 3个基因的同源序列,设计家蚕IE启动子重组载体,并进行shRNA测序。将载体转染入BmN细胞系,通过博来霉素抗生素压力筛选,获得稳定敲降细胞系。随后进行敲降水平的调查,获得3种细胞的基因抑制水平分别约为70%、90%和40%。敲降基因对细胞生长发育的影响:MTT法调查了3种敲降细胞系和BmN的生长速度,结果显示敲降Cry1、Cry2或Per的细胞系,细胞生长速度都慢于对照野生型细胞,其中Per基因敲降细胞系影响最大。细胞形态显微镜观察发现,三种敲降细胞的生长状态均不如对照细胞,也以Per敲降细胞系影响最大。DAPI细胞核染色观察发现,敲降细胞系均出现比对照细胞更多的核异变个体,包括核固缩、变形、碎片化、拉长等多种非正常形态。结果说明,敲降Cry1、Cry2或Per基因均会影响细胞的生长发育,甚至诱导细胞凋亡坏死。敲降基因对细胞代谢状况的影响:代谢组学实验发现,敲降细胞系和正常细胞系具有明显倍率变化的代谢物,包括甘氨酸、乳酸、蔗糖、胆固醇、磷酸盐、十六烯酸和十八烯酸等物质,提示敲降基因可能影响到物质能量代谢。进一步对糖酵解、TCA循环、磷酸戊糖途径的相关酶基因调查发现,敲降细胞系中,糖酵解和TCA循环的关键酶有不同程度的下降表达,最为明显的是这两个通路的限速酶基因6-磷酸果糖激酶(6PFK)和异柠檬酸脱氢酶(ICDH),出现了倍率的下降,下降程度最为明显的也是Per基因敲降细胞系。以上结果表明,敲降生物钟基因Cry1、Cry2或Per,对BmN细胞的生长发育和生理代谢产生了很大影响,其中Per基因的转录抑制效率虽然低于Cry1和Cry2,但影响大于后者。暗示Per基因在鳞翅目昆虫的生物钟系统中可能具有更为关键和重要的作用。