【摘 要】
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目的 在TaqMan 探针法实时荧光定量PCR 中,排除由引物探针聚合延伸引起的假阳性问题以及由引物二聚体(Primer Dimer,PD)引起的假阴性问题。方法 首先对不同探针进行引物探针聚合实验；然后通过双重PCR 的干扰试验选择合适的内标基因,并使用内标质粒检测验证中部同序引物排除PD 干扰的实用性；最后比较探针法不同体系检测HBV 基因的灵敏度。结果 引物与探针聚合实验中,含有反义碱基的H
【机 构】
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中国人民解放军总医院临检科,北京100853;温州医科大学检验医学院,生命科学学院温州325000
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目的 在TaqMan 探针法实时荧光定量PCR 中,排除由引物探针聚合延伸引起的假阳性问题以及由引物二聚体(Primer Dimer,PD)引起的假阴性问题。方法 首先对不同探针进行引物探针聚合实验；然后通过双重PCR 的干扰试验选择合适的内标基因,并使用内标质粒检测验证中部同序引物排除PD 干扰的实用性；最后比较探针法不同体系检测HBV 基因的灵敏度。结果 引物与探针聚合实验中,含有反义碱基的HBVP4在重复试验中未出现假阳性；竞争性双重PCR 和非竞争性双重PCR 两模板开始出现干扰作用的浓度差分别为20 倍和100 倍；对于内标基因,使用中部同序引物对以及普通引物对分别可以检测到10-9 和10-8 稀释度；3 种HBV 基因检测体系,使用普通引物对可以检测到Ct33 左右,加入内标系统和使用中部同序引物对均可检测到Ct35 左右。结论 在TaqMan-分子信标结构调整的基础上引入反义碱基可以在排除由引物和探针聚合延伸引起的假阳性问题；在探针法中,使用中部同序引物对和加入内标系统均可降低PD 的干扰程度,提升检测的灵敏度。
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