【摘 要】
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目的 牛磺酸(Taurine,Tau)是一种内源性的含硫β-氨基酸,在抗衰老、调节渗透压、氧化应激、促进神经系统发育等方面有广泛的生物学作用,对神经组织缺血、缺氧及缺血再灌注损伤具有明显的防治作用.Tau主要是通过细胞膜上高亲和性的牛磺酸转运体(taurine transporter,TAUT)主动跨膜转运而进入细胞的.为了更好地研究Tau在中枢神经系统中的作用和功能,我们采用神经系统特异性启动子
【机 构】
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天津市环湖医院、天津市神经外科研究所 天津市津南区吉兆路6号,300350
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目的 牛磺酸(Taurine,Tau)是一种内源性的含硫β-氨基酸,在抗衰老、调节渗透压、氧化应激、促进神经系统发育等方面有广泛的生物学作用,对神经组织缺血、缺氧及缺血再灌注损伤具有明显的防治作用.Tau主要是通过细胞膜上高亲和性的牛磺酸转运体(taurine transporter,TAUT)主动跨膜转运而进入细胞的.为了更好地研究Tau在中枢神经系统中的作用和功能,我们采用神经系统特异性启动子PGEF,构建了在中枢神经系统特异性表达的TAUT的转基因大鼠,并进行鉴定,为研究Tau在神经系统疾病中的作用和机制提供理想的模型.方法 将牛磺酸转运体基因(S1c6a6)上第5外显子的CDs扩增后插入质粒pPDGF4(+)的NheI和XbaI之间,构建含有神经特异性启动子pPDGF驱动大鼠S1c6a6基因表达的真核表达载体pDGF4(+)-S1c6a6.用PvuI酶切线性化载体.用显微注射法将上述线性化片段注射入SD大鼠受精卵内,经短暂体外培养,筛检存活的胚胎,移植入假孕受体大鼠输卵管,常规饲育,通过PCR方法检测出生大鼠S1c6a6基因的插入和鼠尾组织中大鼠S1c6a6基因的表达,制备阳性的S1c6a6转基因大鼠首建鼠F0.F1代大鼠在出生10-12d用剪趾法编号,收集剪下的脚趾组织,用碱裂解法提取基因组DNA,用PCR法进行基因型检测.分别提取F1阳性大鼠和littlemate大鼠的大、小脑的RNA及蛋白做PCR、Western Blotting鉴定,筛选F0代高表达品系.结果 (1)成功地构建了pDGF4(+)-S1c6a6真核表达载体,繁育出生的大鼠经PCR鉴定,得到2只阳性F0(1＃、6＃)；(2)经传代得到F1代鼠67只,其中阳性、阴性鼠分别是36、31只,阳性率为53.7％,符合孟德尔遗传定律.(3)1＃F0的F1代中阳性大鼠大脑组织中TAUT mRNA表达水平是littlemate的3.58倍,蛋白表达是阴性鼠的2倍；6＃F0的F1代中阳性大鼠大脑组织中mRNA表达平mRNA水平是littlemate的3.92倍；蛋白表达水平上与阴性鼠无显著差异.结论 成功构建神经特异性表达pDGF(+)-S1c6a6的阳性鼠,获得高表达TAUT的转基因大鼠品系(1号F0).
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