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目的脓毒症是由感染因素介导的全身炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome,SIRS),目前大量研究表明,构成革兰阴性菌(Gram-negative,G~-)外膜的主要成分内毒素(lipopolysaccharide,LPS),作为重要的病原体相关分子模式,其诱导脓毒症发生的能力最强,在脓毒症的病理生理过程中发挥着重要的作用。TLR4是单核-吞噬细胞系统识别LPS的模式识别受体,普遍认为,TLR4跨膜信号转导途径介导炎症反应细胞活化,此过程LPS不进入细胞内即可启动信号转导,而LPS入胞以往被认为与代谢降解有关。但最近研究表明,应用内体酸化抑制剂CQ处理巨噬细胞后,LPS内化聚集增多,而本课题组前期实验也证明了CQ可导致巨噬细胞活化程度降低。故本课题设想"内体pH增高将导致LPS在巨噬细胞内聚集增强而细胞活化程度降低",拟用荧光素示踪LPS,应用标准缓冲液以及内体酸化抑制剂CQ同步处理细胞以调节其内体pH,观察LPS在胞内的聚集分布情况和细胞活化情况,以期深化LPS活化巨噬细胞的作用机制,为进一步发现新的药物作用靶点奠定理论和实验基础。方法(1)使用异硫氰酸荧光素(Fluoresceinisothiocynate,FITC),检测其标记效率并于激光共聚焦显微镜下观测示踪效果。(2)利用标准缓冲溶液调节巨噬细胞内体pH,并进一步使用不同浓度CQ处理细胞,用FITC-Dextran作为内体pH荧光探针观测荧光强度值,以其作为媒介换算得到CQ浓度与内体pH值的对应关系。(3)用对应到内体pH梯度的CQ浓度刺激RAW264.7细胞,观察不同内体pH条件下LPS在胞膜及内体中的分布。(4)用梯度浓度的CQ预处理RAW264.7细胞,并使用ELISA方法检测细胞因子IL-6和TNF-a,以确定细胞活化情况。结果(1)使用FITC标记LPS,经超滤方法纯化后标记效率高,激光共聚焦下观察示踪效果好。(2)以内体pH特异性荧光探针FITC-Dextran观测的荧光值作为两个不同处理因素:标准pH缓冲液和梯度浓度CQ的换算媒介,得到了CQ刺激浓度与内体pH的对应关系,制作了标准曲线。(3)毒性范围内梯度浓度的CQ预处理巨噬细胞之后,LPS在胞内的聚集随着CQ的浓度增加而增加。(4)经CQ预处理的RAW264.7巨噬细胞,随着CQ浓度增加,细胞因子TNF-a和IL-6释放减少,表明细胞活化被抑制。结论以荧光素FITC示踪LPS,以内体酸化抑制剂CQ调节RAW264.7细胞内体pH,观察LPS在胞内的聚集分布情况和细胞活化情况,得到随着内体pH增高导致LPS在巨噬细胞内聚集增多,并且细胞活化程度降低。