论文部分内容阅读
[背景]黄花棘豆(Oxytropis ochrocephala Bunge)是一种疯草(豆科棘豆属和黄芪属有毒植物),广泛分布于我国宁夏、甘肃、青海、西藏等西部省区,动物长期或过量采食黄花棘豆会发生以神经系统机能紊乱为特征的慢性中毒病,表现为共济失调、四肢麻痹瘫痪、流产、不孕不育等症状,严重的会发生大批死亡.苦马豆素(swainsonine,SW)是黄花棘豆的主要毒性成分,它是一种吲哚里西啶生物碱,该生物碱能够抑制细胞内溶酶体α-甘露糖苷酶和高尔基体糖苷酶Ⅱ的活性,导致低聚糖代谢和功能性糖蛋白合成障碍,细胞发生空泡变性和组织器官功能紊乱.目前,SW在动物机体内的毒理作用机制和在疯草中的合成机制还未被阐明,因此,动物疯草中毒问题仍未能从根本上得到解决.近年研究表明,疯草中普遍存在一类能够产生SW的内生真菌.20世纪末,Braun等从3种美国疯草中均分离到一类能够产生SW的内生真菌,该类真菌生长特性和形态结构相近,根据真菌ITS序列信息,将其初步划分为链格孢属(Alternaria)真菌.后来,Braun等应用丙环唑诱导该类真菌产生分生孢子等形态结构,结合真菌的ITS、β-tublin等序列信息,将其进一步划分为埃里砖格孢属(Embellisia)真菌,并初步确定疯草中SW的含量和该类内生真菌感染的程度紧密相关.随后,我国学者王琦、卢萍、余永涛等从中国的疯草中分离到能够产SW的内生真菌.2009年Pryor等根据美国疯草中产SW内生真菌的形态特征及甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, gpd)、内部转录间隔区序列(internal transcribed space,ITS)、线粒体核糖体小亚基(mitochondrial small subunit rDNA,mt SSU)序列等序列信息,对产SW疯草内生真菌进行了系统的真菌分类学研究,将美国疯草中的产SW内生真菌重新划分为一个新的属——Undifilum,并统一命名为U.oxytropis.目前,国外学者已对内生真菌U.oxytropis与疯草中SW含量的关系进行了系统研究,认为U.oxytropis是疯草中SW产生的主要因素,与疯草的毒性紧密相关,抑制该类内生真菌在疯草中的生长和繁殖将有望消除或降低疯草的毒性.本研究对宁夏黄花棘豆中的产SW内生真菌进行了分离和筛选,诱导其产生分生孢子,克隆和测定真菌的gpd、ITS、mt SSU等基因序列,根据真菌形态和遗传进化分析结果对其进行重新的种属分类,为进一步研究疯草内生真菌合成SW的分子调控机理提供菌种和奠定基础.[目的]对宁夏黄花棘豆中产苦马豆素内生真菌进行分离和鉴定,为进一步研究疯草内生真菌合成苦马豆素的分子调控机理提供菌种和奠定基础.[方法]：分离并纯化黄花棘豆植物组织中的真菌,采用气相色谱质谱联用法对各菌株菌丝中的苦马豆素进行分析,筛选能够产生苦马豆素的内生真菌；紫外线照射和黑暗交替培养诱导内生真菌产孢；提取真菌DNA,扩增和测定真菌甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,gpd)、内部转录间隔区序列(internal transcribed space,ITS)、线粒体核糖体小亚基(mitochondrial small subunit rDNA,mt SSU)序列,进行同源性比较和遗传进化分析,对其进行种属分类和命名.[结果]从宁夏黄花棘豆中共分离到5株真菌,其中菌株NX-FEL001菌丝中含有苦马豆素,经诱导培养,该菌株能够产生分生孢子及分生孢子梗等结构,序列同源性和系统发育分析表明该菌株与Undifilum真菌的亲缘关系最近,根据形态结构和分子进化分析结果将菌株NX-FEL001鉴定为Undifilum oxytropis.[结论]宁夏黄花棘豆中存在产SW的内生真菌,经诱导培养,菌株NX-FEL001能够产生分生孢子及分生孢子梗等结构,序列同源性和系统发育分析表明该菌株与Undifilum真菌的亲缘关系最近,根据形态结构和分子进化分析菌株NX-FEL001鉴定为Undifilum oxytropis.