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背景:B细胞活化、增殖和分化为抗体产生细胞是机体体液免疫应答的主要过程,在疾病防御中发挥十分重要的作用。然而,针对自身抗原和过敏原的B细胞的过度激活会导致自身免疫性疾病和过敏性疾病。目的 :本研究将通过优化诱导B细胞活化、增殖和分化的条件,为B细胞特异性免疫抑制剂的活性评价提供方法。方法:利用磁珠分选法获得纯化BALB/c小鼠脾脏B淋巴细胞,加入anti-IgM(10μg/ml)、anti-CD40(10μg/ml)、IL-4(10ng/ml)及其组合分别进行刺激,培养24h后,流式细胞术检测B220~+B细胞表面活化标志物CD69和CD86的表达;培养72h后,CCK-8法和CFSE法检测B细胞存活及增殖情况;同样在培养72h后,流式细胞术检测B220~+CD138~+浆细胞的比例,并利用ELISA法检测细胞培养上清中IgM、IgG抗体浓度;最后在刺激多个时间点后,收集细胞进行Western Blot检测活化B细胞中NF-κB、MAPK、PI3K-Akt和STATs信号通路的激活情况。结果 :在B细胞活化作用测定中,流式检测结果显示anti-IgM+anti-CD40+IL-4(AAI)的组合刺激B细胞表面活化标志物CD69和CD86上调效果最为显著。B细胞增殖实验中,CCK-8和CFSE检测结果发现AAI的组合刺激B细胞增殖作用效果最佳。B细胞分化实验中,流式检测结果表明anti-CD40+IL-4(AI)的组合刺激B细胞向浆细胞分化的比例最高,anti-CD40是刺激B细胞分化的主要因素,IL-4也有一定促进作用。AI的组合诱导B细胞分化的细胞上清中,IgM和IgG抗体浓度也显著升高。此外,WesternBlot检测结果显示,MAPK信号通路中ERK和JNK的磷酸化在刺激0.5h时获得最大程度激活,NF-κB信号通路中p65和I-κB,PI3K-Akt信号通路中Akt和STATs信号通路中STAT3、STAT6的磷酸化均在刺激后3h时被最大程度激活。结论 :上述结果表明,采用AAI组合能够最大程度刺激B细胞活化和增殖,AI组合能够最大程度刺激B细胞分化,其相关信号通路可以在刺激后0.5-3h获得最大程度激活。这类刺激组合可以用于评价B细胞特异性的免疫抑制剂的活性,通过优化的刺激时间来进行信号通路研究可以揭示这类抑制剂的作用机制。