【摘 要】
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为建立猪肺炎支原体(Mhp)显色原位杂交(CISH)定位检测方法，为本研究利用地高辛标记的MhpP36核酸探针和DAB／H2O2显色系统，对人工感染组、自然感染组和健康对照组的实验猪肺样品和临床样品进行显色原位杂交检测。结果显示，设计的地高辛标记探针针对Mhp具有特异性，而与其他的猪病原菌无交叉反应；检测结果可以通过显微镜观测到Mhp定位在支气管／细支气管黏膜表面。此外，人工感染组、自然感染组和健
【机 构】
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江苏省农业科学院兽医研究所·农业部兽用生物制品工程技术重点实验室／国家兽用生物制品工程技术研究中心，江苏南京 210014
【出 处】
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中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第九次学术研讨会
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为建立猪肺炎支原体(Mhp)显色原位杂交(CISH)定位检测方法，为本研究利用地高辛标记的MhpP36核酸探针和DAB／H2O2显色系统，对人工感染组、自然感染组和健康对照组的实验猪肺样品和临床样品进行显色原位杂交检测。结果显示，设计的地高辛标记探针针对Mhp具有特异性，而与其他的猪病原菌无交叉反应；检测结果可以通过显微镜观测到Mhp定位在支气管／细支气管黏膜表面。此外，人工感染组、自然感染组和健康对照组的CISH结果与PcR检测结果一致，临床样品的CISH检测结果低于户CR检测结果。本研究建立的Mhp显色原位杂交法是一种集直观和敏感为一体的检测方法，可以用于Mhp的定位检测和致病机理研究。
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Alphavirus replicon-based DNA vaccines have emerged as a promising approach to generation ofantigen—specific immune responses．However，due to their low immunogenicity，there is a need for other approach
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为构建稳定表达猪瘟病毒(CSFV)Npro蛋白的PK-15细胞系，本研究采用PCR方法，以pOKl2／F1-9质粒为模板扩增Npro基因，并引入Flag标签序列，将其连到plRES2-EGFP载体，构建重组质粒pGFP-Npro；通过脂质体将pGFP．Npro转染至PK-15细胞中，利用G418加压筛选、纯化得到稳定表达Npro蛋白的细胞系；连续传代30代后，进行RT—PCR、Western bl
为了探讨猪圆环病毒2型(PCV2)作为表达外源表位的可行性，本研究构建了以PCV2基因组为骨架。在ORF2编码Cap蛋白的C末端插入了源自副流感病毒5型的一个含14氨基酸序列的V5表位标签，用构建感染性分子克隆重组质粒转染细胞，拯救出一株表达V5表位标签的重组毒株，命名为recPCV2／CL—V5。采用免疫过氧化物酶单层试验(IPMA)、血清中和试验(SNA)、捕获ELISA及免疫电镜对重组毒株进
RNAi(RNA interfererice)已成为特异抗病毒治疗研究的热点，但siRNA(small interfering RNA)的定量检测仍是评价RNAi抗病毒效果的瓶颈。为了检测抗CSFV特异siRNA分子(siNl和siN2)在细胞中的表达水平，设计并以交叉组合方法筛选了具有较高特异性和灵敏度的siRNA特异茎环引物(SLP-N1-6和SLP-N2-8)，成功地建立了最优的siNl和s
为评价猪圆环病毒(PcV)2a／2b两种基因型毒株及其重组cap蛋白(rCap)之间的交互免疫效果，本研究采用PCV2a-LG和PCv2b-YJ株制备了2种病毒灭活疫苗，及其重组杆状病毒表达的2种C印蛋白(PCv2a-rap和PCv2b-rap)亚单位疫苗。选用8周龄BALB／c鼠165只，随机分成11组，每组15只，用上述4种疫苗各免疫2组，以Pcv2a或Pcv2b毒株攻毒。攻毒后，所有鼠均未见
将纳米PCR技术引入非洲猪瘟病毒(AsFV)检测，建立了ASFV病毒高效纳米PCR检测方法。使用该方法同时检测大肠杆菌(E．coli)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪圆环病毒II型(PCV-2)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRsV)、猪捷申病毒(PTV-8)、猪脑心肌炎病毒(EMCV)，结果只有ASFV病毒中P54基因扩增出552bp的目的片段。敏感性表明比普通PCR对照实验结果
为表达猪输血传播病毒1型(PTTV1)cap蛋白用于单克隆抗体(MAb)的制备，以含PTTV1全长基因组的质粒(pMD18-TTV1-SY13)为模板，用高保真PCR法扩增PTTV1-ORF1(1501～2475 nt)编码的Cap蛋白C末端截短序列(324 aa)，引物两端设计了salI和Not I酶切位点，将PcR产物克隆到pGEx-6P-1载体，构建的重组质粒命名为pGEx-TTV1-ORF
通过重叠延伸PCR(SOE-PcR)方法扩增猪细小病毒BQ-C株的NS2、NS3基因，并将其克隆至原核表达载体pET-30a(+)上，分别构建出重组表达质粒pEToNS2、pET-NS3。用不同浓度的IPTG进行诱导表达，SDS．PAGE分析表明pET-NS2重组蛋白在IPTG浓度为1．2 mM、温度为37℃、诱导4 h时表达量最大，分子量为25 ku；pET-NS3重组蛋白在IPTG浓度为1 m