【摘 要】
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构建针对人类基因组rDNA序列的TALEN质粒,并构建针对该位点的人类通用基因打靶载体.运用在线软件在人基因组rDNA序列上寻找TALEN识别序列,构建2个TALEN左臂质粒和3个TALE
【机 构】
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佛山大学院医学院,广东省佛山市,528000
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构建针对人类基因组rDNA序列的TALEN质粒,并构建针对该位点的人类通用基因打靶载体.运用在线软件在人基因组rDNA序列上寻找TALEN识别序列,构建2个TALEN左臂质粒和3个TALEN右臂质粒,通过配伍组合,得到6对TALEN.利用非脂质体转染法将TALEN质粒转染至293T细胞,嘌呤霉素阳性筛选后提取基因组DNA,PCR扩增靶序列,通过测序结果判断TALEN活性,最终得到一对切割活性高达78.5％的TALEN(TALEN-L1R2).同时,以人基因组DNA为模板,PCR扩增TALEN切割位点两侧基因序列作为左右同源重组引导序列,克隆到载体pUC-19中,得到重组质粒pUC-DS1-DS2.采用In-fusion酶系统将从载体pEGFP-N1中扩增的EGFP表达元件(pCMV-MCS-EGFP)克隆至pUC-DS1-DS2.酶切鉴定和测序证实成功构建人类细胞通用的基因打靶载体pUC-DS1-EGFP-DS2,并证实两种载体共转染能成功将目的基因GFP整合于基因组中.TALEN和基因打靶技术的结合,是一种有效基因组编辑新技术,将为动物基因组编辑和人类基因治疗建立关键技术.
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